糯玉米品种‘沪玉糯3号’种子真实性与纯度鉴定的SSR核心引物筛选

卢 媛,韩 晴,王义发,沈 渊,沈新芬,瞿玉玑,施 标,沈雪芳∗

（1上海市农业科学院作物育种栽培研究所,上海201403;2上海市金山区农业技术推广中心,上海201599;3上海市青浦区朱家角镇农业综合服务中心,上海201713;4上海市农业科学院,上海201403）

近年来,我国种业市场迅速发展,同时也出现了制售假劣种子、种子混杂及套牌侵权等违法行为,造成种子市场的混乱,严重侵害农民的利益,影响我国种业的健康可持续发展。因此,加强对玉米杂交种的真实性和纯度监管显得非常必要[1-2]。传统的表型鉴定工作量大,周期长,深受环境条件影响,不利于种子营销工作的开展;而同工酶和种子贮藏蛋白鉴定多态率低,重复性差,以上方法均已无法满足玉米品种真实性和纯度鉴定的需要。目前,基于分子标记技术的DNA指纹鉴定技术已成为品种真实性和纯度鉴定的重要手段[3-4]。SSR标记具有易分析、多态率高、分布均匀、重复可靠、快速、准确的特点,是目前应用较多的分子标记技术。我国农业部已颁布了利用核心SSR分子标记技术对国家及省区试玉米品种真实性和一致性进行DNA指纹鉴定的行业标准（《NY∕T 1432—2014玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法》）。DNA指纹鉴定技术在种子真实性和纯度鉴定上的应用,为从源头上控制玉米品种多、乱、杂现象提供了技术支撑。

‘沪玉糯3号’是由上海市农业科学院选育的拥有自主知识产权的优质、高产鲜食糯玉米品种,于2002年通过上海市审定[沪农品审玉米（2002）第007号]。‘沪玉糯3号’熟期早、产量较对照‘苏玉糯1号’增产13.6%,品质好,适用于加工,在我国长三角地区推广面积较广,市场影响力大。本研究利用40对SSR核心引物,对2个待测品种的真实性进行鉴定,并从中筛选出6对可用于‘沪玉糯3号’纯度鉴定的SSR分子标记,同时,建立‘沪玉糯3号’及其亲本的DNA指纹图谱,旨在为加强‘沪玉糯3号’的产权保护及种子质量监测工作提供理论依据和技术保障。

1 材料与方法

1.1 供试材料

‘沪玉糯3号’是以自交系申W48（原名SW48）和申W22（原名SW22）为亲本组配的优质、高产糯玉米单交种。选用‘沪玉糯3号’标准品、2个待检测品种,以及16份糯玉米品种‘沪紫黑糯1号’‘申糯2号’‘佳糯668’‘斯达糯41’‘京科糯656’‘苏玉糯5号’‘金玉糯9号’‘京科糯609’‘苏科糯1501’‘天贵糯932’‘大玉糯2号’‘申糯8号’‘晶彩糯’‘浙糯玉10’‘晋糯20号’‘京科糯2000’进行试验。以上材料由上海市农业科学院玉米遗传育种课题组提供。

1.2 DNA提取及质量检测

2016年5月分别在‘沪玉糯3号’、申W48和申W22中各选取20个大小和色泽均匀一致的籽粒在培养皿中培育至二叶一心期,混合剪取幼苗。于田间采集上述16份糯玉米品种叶片,样品置于-20°C冰箱保存备用。采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的DNA提取试剂盒,利用改进后的CTAB法,提取DNA[5]。利用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计（Thermo,USA）检测DNA质量。

1.3 SSR引物合成

40对引物序列信息见行业标准《NY∕T 1432—2014玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》,引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 PCR扩增

10 μL 反应体系包含100 ng 基因组 DNA、左右引物各2 μmol∕L、2.5 mmol∕L dNTRs、2.5 mmol∕L MgCl2、1 ×RCR buffer（10 mmol∕L Tris-HCl,pH 8.5,50 mmol∕L KCl）和 0.5 U Taq 酶。 RCR 反应的程序为:94 ℃预变性3 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,36个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。RCR产物加入2 μL 6×loading buffer,混匀后,变性,程序为:95℃变性5 min,4℃冷却10 min以上。

RCR产物变性后在4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。90 V预电泳20 min,80 V电泳至上部指示条带到达胶板中部。用质量分数0.1%的AgNO3溶液银染12 min;显影液（2%NaOH,1%甲醛）显影直至谱带清晰,拍照。

1.5 结果判定与数据统计

参照《玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法》（NY∕T 1432—2014）进行判定,若20个SSR基本核心位点中,差异位点数≥2,判定为不同品种;差异位点数≤1,继续用20对扩展核心引物进行检测。若累计40个SSR位点中,差异位点数≥2,判定为不同品种;差异位点数=1,判定为近似品种;差异位点数=0,判定为相同品种。

SSR扩增带型以0、1、9统计,在相同迁移率位置上,无带记为“0”,有带记为“1”,缺失记为“9”,建立0、1、9 数字指纹数据库。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

‘沪玉糯3号’、申W48、申W22和2个待测样品的OD260∕OD280比值均接近1.8,质量浓度在790—990 ng∕μL,表明本研究提取的样品DNA质量较好,可用于RCR鉴定（表1）。

表1 DNA质量和质量浓度检测Table 1 DNA quantification and quality determinations

2.2 ‘沪玉糯3号’品种真实性鉴定

首先,利用20对SSR基本核心引物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对‘沪玉糯3号’标准品和2个待测样品进行鉴定,发现待测品种1和‘沪玉糯3号’间有6个SSR位点存在差异,差异位点数＞2,说明待测品种1和‘沪玉糯3号’不是同一品种;待测品种2和‘沪玉糯3号’间无SSR差异位点（表2）。为了进一步确定待测品种2的真实性,利用20对SSR扩展核心引物对待测品种2和‘沪玉糯3号’进行RCR鉴定,在待测品种2和‘沪玉糯3号’间也未发现SSR差异位点,推测待测品种2和‘沪玉糯3号’为同一品种（表 2）。

表2 2个待测品种与‘沪玉糯3号’的真实性检测Table 2 Authenticity Assessment of the two test varieties

2.3 ‘沪玉糯3号’纯度鉴定特异引物筛选

利用40对均匀分布于玉米10条染色体上的SSR核心引物,在‘沪玉糯3号’及其亲本申W48和申W22间进行扩增,发现18对SSR标记能在申W48和申W22间扩增出多态性条带,其中,显性标记6对,共显性标记12对。为进一步确定可用于‘沪玉糯3号’纯度鉴定的SSR标记,对以上12对共显性标记再次进行了 RCR 扩增,发现 SSR 引物 bnlg1940k7、bnlg2305k4、umc1536k9、bnlg249k2、bnlg2235y5、phi233376y1可在申W48和申W22之间扩增出清晰、稳定的多态条带,且它们在‘沪玉糯3号’中均能扩增出双亲杂合带型（图1）,推测这6对SSR核心引物可用于对‘沪玉糯3号’的纯度鉴定。

图1 在‘沪玉糯3号’亲本间存在差异的SSR位点Fig.1 SSR markers could amplify polymorphisms between parents of‘Huyunuo No.3’

2.4 ‘沪玉糯3号’品系特异性鉴定

在40对玉米SSR核心引物中,引物对bnlg1940k7和bnlg2305k4既可在‘沪玉糯3号’和待测品种1间扩增出稳定的多态性条带,还能在‘沪玉糯3号’的亲本申W48和申W22间扩增出双亲互补带型。因此,利用SSR标记bnlg1940k7和bnlg2305k4在‘沪紫黑糯1号’‘申糯2号’‘佳糯668’‘斯达糯41’等16个糯玉米品种的基因组DNA中进行RCR扩增,以获得可用于‘沪玉糯3号’品系特异性分析的SSR分子标记。引物对bnlg1940k7和bnlg2305k4均可在‘沪玉糯3号’中扩增出与其他16个糯玉米品种不同的差异带型,进一步说明SSR标记bnlg1940k7和bnlg2305k4可用于‘沪玉糯3号’品种的真实性鉴定（图2）。

图2 ‘沪玉糯3号’品系特异性鉴定Fig.2 Event-specific identification of‘Huyunuo No.3’

2.5 ‘沪玉糯3号’及其亲本数字指纹图谱构建

为了使DNA指纹更加直观,利用计算机对‘沪玉糯3号’进行品种真实性和亲缘关系鉴定,根据常用数据转换模式,将33对扩增条带清晰的玉米SSR核心引物在‘沪玉糯3号’及其亲本中扩增的DNA指纹转换成由0和1组成的计算机可识读的语言（表3）,以便于今后数据库的录入和与其他品种、自交系的DNA指纹图谱比对。

表3 ‘沪玉糯3号’及其亲本的数字指纹数据库Table 3 Numeric fingerprint database of‘Huyunuo No.3’ and its parental inbred lines

3 讨论与结论

随着分子标记技术的快速发展,SSR分子标记已被广泛应用于玉米品种的真实性和纯度鉴定。在筛选适用于玉米杂交种真实性和纯度鉴定的引物时,虽然基本要求相同,但是在选择侧重点上仍有所不同:真实性鉴定侧重于引物多态率,要求引物多态率高,且多个引物间不连锁或连锁不紧密,而对杂合率指标没有特殊要求;纯度鉴定则侧重于引物杂合率,在杂交种中能扩增出双亲互补带型,其次才是多态性指标。

张振良等[6]利用部颁标准NY∕T 1432—2014中公布的20对SSR核心引物,对5个糯玉米疑似杂交种的真实性进行鉴定,鉴定结果与田间鉴定结果一致,说明利用这些SSR标记可以对玉米品种的真实性进行准确鉴定。本研究利用NY∕T 1432—2014标准中公布的40对SSR核心引物对2个糯玉米疑似品种进行了真实性鉴定。 SSR 引物对 umc2007y4、bnlg1940k7、bnlg2305k4、bnlg1702k1、umc1125y3、phi080k15 能在待测品种1和‘沪玉糯3号’间扩增出带型清晰、稳定性好的多态条带,说明这6个SSR位点在‘沪玉糯3号’中的多态性和特异性较好;此外,SSR标记 umc2007y4、bnlg1940k7、bnlg2305k4、bnlg1702k1、umc1125y3和phi080k15分别分布于玉米2号、2号、5号、6号、7号和8号染色体,连锁不紧密,今后在‘沪玉糯3号’品种真实性鉴定中可优先使用以上6对SSR核心引物,可减少工作量、降低试验成本。

Yashitola等[7]认为对于特定品种,仅需1对特异引物就可以鉴定品种纯度。然而,谭君等[8]认为仅用1对引物检测种子纯度是不准确的,一般需要利用3—5对引物才能准确鉴定种子纯度。本研究从大量的玉米SSR引物中挑选出40对多态性较高的引物[9],从中筛选出6对能在‘沪玉糯3号’中扩增出清晰、稳定的双亲互补带型的引物对 bnlg1940k7、bnlg2305k4、umc1536k9、bnlg249k2、bnlg2235y5 和phi233376y1。通过这6对引物的组合使用,可以满足对‘沪玉糯3号’种子纯度鉴定的需要。

在‘沪玉糯3号’品种真实性和纯度鉴定工作中,利用本研究筛选的SSR核心引物,结合构建的DNA指纹图谱,可在较短时间内对‘沪玉糯3号’品种进行大规模的真实性和纯度鉴定,这不仅满足了对种子真实性和纯度鉴定简便、快速、准确、高效的要求,同时也节省了大量的人工和试剂,降低了检测成本。