过硫酸盐降解土壤中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的研究

周佳欣,姚春霞∗,孙明星,白 冰∗∗,周昌艳∗∗

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海201403;2上海出入境检验检疫局,上海200135）

氯霉素类抗生素是一类具有1-苯基-2-氨基-1-丙醇的二氯乙酰胺衍生物,又称酰胺醇类,这类抗生素包括氯霉素（Chloramphenicol）及其衍生物甲砜霉素（Thiamphenicol）、氟甲砜霉素（Florfenicol）等（图 1）。氯霉素作为廉价的广谱抗生素,被广泛用于人、畜多种传染性疾病的治疗[1]。研究发现氯霉素对人的造血系统、消化系统具有严重的毒性反应,长期微量摄入氯霉素可诱发致病菌的耐药性,导致机体正常菌群失调,使人们易感染各种疾病。鉴于以上原因,很多国家和地区开始禁止或者严格限制使用氯霉素[2],中国也将其列入农业部《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》公告,规定在所有动物性产品中氯霉素不得检出[3]。甲砜霉素和氟甲砜霉素属氯霉素类药物,广泛用于治疗猪、牛、禽及水产养殖动物的细菌性疾病,加之氯霉素被许多国家禁用,因而这两种药物成为目前水产养殖中最广范使用的药物之一。现除我国与日本外,欧共体和美国将甲砜霉素和氟甲砜霉素禁用于动物食品。目前很多国家都已制定关于甲砜霉素和氟甲砜霉素的最大残留限量[4-6]。

图1 氯霉素（a）、甲砜霉素（b）和氟甲砜霉素（c）化学结构式Fig.1 Chemical structure of chloramphenicol（a）,thiamphenicol（b）and florfenicol（c）

氯霉素类抗生素广泛地应用于畜牧养殖和水产养殖业,一方面,抗生素药物的不合理使用可能导致土壤中药物残留,以及畜禽抗生素蓄积中毒,对消费者健康构成威胁;另一方面,抗生素药物会以原形化合物或代谢产物的方式从粪、尿等排泄物进入环境,这些药物或代谢产物在环境中往往能维持很长时间的活性,对微生物、部分动植物产生不同程度的影响,造成土壤污染,给生态环境带来负面影响[7-11]。

对于受氯霉素类抗生素污染的土壤,能够采用的控制技术众多,如微生物技术、膜处理技术、辐照技术等等[12-15],但存在着耗时长、需要场地大,有仪器和环境条件限制等问题,无法广泛推广。过硫酸盐经过活化产生的硫酸根自由基有较强的氧化活性,被广泛应用于处理毒性强的难降解有机污染物[16-20]。过硫酸盐需经过活化才具有活性,热活化法和UV活化法可对土壤进行处理,但是所需能源消耗量大、程序比较复杂,增加了处理的费用,难以实现大规模应用。而过渡金属离子活化法在常温常压下进行,操作方式相对简单,易于实现。因此,本研究对过硫酸盐降解土壤中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素进行分析,确定最佳反应条件和参数,旨在提供一种高效、无二次污染、操作简便的方法,降低土壤中氯霉素类抗生素残留。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

样品的采集:取农业用地土壤样品1000 g,烘干后研磨,过100目筛（孔径0.15 mm）,放入广口瓶备用。

药品与试剂:氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准品（纯度均≥98%,购自Sigma公司）,制备氯霉素类药物储备液10 mg∕L,储存于棕色玻璃瓶中,-20℃下避光保存。过硫酸钾、硫酸亚铁、0.22 μm有机滤膜（中国安谱公司）。甲醇（色谱纯,美国Merck公司）;乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、丙酮（色谱纯,上海安谱公司）;实验室用水为超纯水。

主要仪器:液相色谱-串联质谱仪（电喷雾离子源,美国Waters公司）、ACQUITY URLC BEH C18色谱柱（1.7 m,2.1 mm×100 mm）（美国 Waters公司）;HGC-24A氮吹仪（中国Hengao公司）;MX-F涡动混合器（中国Dragonlab公司）、5415D离心机（德国Eppendorf公司）;

1.2 分析方法

1.2.1 样品前处理

样品提取:参照文献[21-23],称取2 g土壤样品于50 mL具塞离心管中,加入磷酸盐缓冲液,涡旋混合30 s后静置15 min;加入氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯∶25%氨水=98∶2,V∕V）涡旋混合30 s,超声波提取10 min;以8000 r∕min离心5 min,转移上层有机溶液于45℃水浴中旋转蒸发至干,加入4 mL 4%氯化钠溶液使之充分溶解,待净化。

净化:上述溶液用5 mL正己烷净化脱脂,离心后弃去正己烷层;水层加入8 mL丙酮,离心后转移上清液于50 mL具塞离心管中,加入10 mL二氯甲烷,涡旋30 s;以8000 r∕min离心5 min,转移下层有机溶液于45℃水浴中旋转蒸发至干,用1 mL甲醇-水（20∶80,V∕V）溶解残留物,经0.45 μm滤膜过滤后上机测定。

1.2.2 仪器分析条件

色谱条件:流动相为甲醇:10 mmol∕L 醋酸铵水溶液（30∶70,V∕V）,含 0.1%冰醋酸,流速 0.2 mL∕min;柱温25℃。ESI（-）MRM检测。毛细管电压1.5 kV;源温度80℃;去溶剂温度350℃;锥孔气流30 L∕h,去溶剂气流400 L∕h,碰撞气体为氩气,碰撞气压0.25 Ra。

质谱条件:采用电喷雾离子源（ESI）,负离子扫描,喷雾电压2500 V,源内诱导解离电压10 V,多反应监测（MRM）方式检测,其他质谱条件见表1。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素优化的质谱条件Table 1 The optimized MS-MS conditions for chloramphenicol,thiamphenicol and florfenicol

2 结果与分析

2.1 不同初始pH对降解率的影响

称取经过粉碎混匀的黏土样品2 g,外源添加氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素,含量为10 mg∕kg,加入0.1 mol∕L过硫酸钾水溶液2 mL,加入0.1 mol∕L硫酸亚铁溶液2 mL,将反应体系的初始pH分别调节为3、5、7、9、11,充分混匀,37℃静置反应4 h,同时以未添加硫酸亚铁和过硫酸钾的空白样品为对照,经液相色谱-质谱联用仪检测氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素浓度。图2结果表明,在酸性条件下,氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素降解率较高。在pH为3的条件下,降解速度最快,当反应时间为1 h时,3种抗生素的降解率达到70%以上;当反应时间为2 h后,反应达到正向平衡。而在碱性条件下,降解率较低,且降解速度较慢。因此本研究选取初始pH为3作为试验初始条件。

图2 初始 pH 分别为3、5、7、9、11 时氯霉素（a）、甲砜霉素（b）、氟甲砜霉素（c）的降解效果Fig.2 Degradation of chloramphenicol（a）,thiamphenicol（b）and florfenicol（c）at different pH value（pH value=3,5,7,9 and 11）

2.2 不同金属离子活化过硫酸盐条件下的降解效果

根据参考文献[18-19],过硫酸盐可在金属离子的过渡激发态条件下活化而产生硫酸根自由基,进而氧化有机物。已有文献报道的金属离子包括Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Co2+等等。结合金属离子的安全性,本研究选取Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+作为活化离子,考察其对过硫酸盐氧化作用的活化效果。

称取经过粉碎混匀的黏土样品2 g,外源添加氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素,含量为10 mg∕kg,加入0.1 mol∕L 过硫酸钾水溶液 2 mL,加入 0.1 mol∕L FeSO4、CuSO4、MnSO4和 ZnSO4水溶液 2 mL,调节反应体系初始pH分别为3,充分混匀,37℃静置反应4 h,同时以未添加金属离子和过硫酸钾的空白样品为对照,经液相色谱-质谱联用仪检测氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素浓度。图3结果表明,活化效果Cu2+最好,其次是Fe2+,Mn2+、Zn2+也有一定的活化效果,但是其产生的降解速度和降解率均低于Fe2+。由于Fe2+在土壤中天然存在,不会造成二次污染,且具有价格低廉、容易获取等优点,在推广使用方面具备优势,因此本研究选择Fe2+作为活化剂。

图3 活化金属离子为 Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+时氯霉素（a）、甲砜霉素（b）、氟甲砜霉素（c）的降解效果Fig.3 Degradation of chloramphenicol（a）,thiamphenicol（b）and florfenicol（c）at different transition metal ions（Fe2+,Cu2+,Mn2+and Zn2+）

2.3 不同亚铁离子与过硫酸盐的配比条件下的降解效果

对过硫酸盐和Fe2+在实际应用中的投放比例进行优化。称取经过粉碎混匀的黏土样品2 g,外源添加氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素,含量为10 mg∕kg。基于以上两项试验结果,选取Fe2+作为活化金属离子,调节试验体系使pH为3。将过硫酸钾与硫酸亚铁溶液按照不同配比添加入反应体系,充分混匀,37℃静置反应4 h,同时以未添加金属离子和过硫酸钾的空白样品为对照,经液相色谱-质谱联用仪检测氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素浓度。

图4结果表明,当过硫酸钾∶Fe2+∶氯霉素类抗生素的摩尔质量比为40∶20∶1时,氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素降解率分别为80.9%,79.2%和78.4%,降解率较高。此后,提高过硫酸钾∶Fe2+投入量,降解率没有显著增加。因此,推荐40∶20∶1的摩尔质量比为最佳的试验投入比。

图4 不同过硫酸钾∶Fe2+∶氯霉素类抗生素的摩尔质量比条件下氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的降解效果Fig.4 Degradation of chloramphenicol,thiamphenicol and florfenicol at different ratios of persulfate∶Fe2+∶contaminants

3 讨论与结论

该技术切实有效,已得到广泛的应用。已有文献报道,通过热活化、UV活化、γ射线活化等方式激活过硫酸盐,应用于水溶液中磺胺类抗生素、泰乐霉素等污染物的降解,可达到较高的降解率[16-20]。

本研究结果表明,S2O82-经Fe2+活化降解土壤中氯霉素类抗生素,可达到较高的降解率。经优化得到最佳反应参数:在酸性条件下的降解效果优于碱性条件,当pH为3时,降解率最高;过硫酸钾∶Fe2+∶氯霉素类抗生素的摩尔质量比为40∶20∶1时,氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素降解率分别为80.9%,79.2%和78.4%,降解效果最佳。

本研究为亚铁离子活化过硫酸盐降解土壤中的抗生素提供一种新技术,该技术高效、安全、无二次污染、易操作,可安全应用于农业环境,为开发新型高效的土壤中抗生素处理技术及工艺提供技术支撑。