菜用大豆耐盐品种资源鉴定及其耐盐生理机理研究

李超汉,杨红娟∗,高亚达,朱丽华,宋荣浩,顾卫红∗∗

（1上海市农业科学院园艺研究所∕上海市设施园艺重点实验室,上海201106;2上海农林职业技术学院,上海201600;3上海市农业科学院生态环境保护研究所,上海201403）

我国盐渍土分布广泛,盐碱土的总面积超过9000万hm2[1],且受全球温室效应、环境污染和化肥施用不当等因素影响,土壤盐渍化日趋严重[2],农业可持续发展受到严重威胁。盐胁迫作为最严峻的环境胁迫之一,不仅影响植物水分吸收,还协同Na+和Cl-毒害致使叶片失绿、生物量降低,严重时导致死亡[3]。作物耐盐新品种的培育是开发利用盐渍土壤,推进盐碱地区农业产业发展,提高社会效益和经济效益的最有效、最环保的方法。

菜用大豆[Glycine max（L.）Merrill]俗称毛豆,是指豆荚处于鼓粒盛期至初熟期即采收作为蔬菜的大豆类型,其营养丰富、味道鲜美,是我国和东南亚国家居民喜食的传统特色蔬菜。我国菜用大豆地方品种资源十分丰富,但是,不同大豆品种对盐胁迫的耐受性存在着较大的差异。为从大豆种质资源中挖掘鉴定耐盐种质,邵桂花等[4]利用电导率15—17 mS∕cm的咸水灌溉大田,从1716份大豆资源中筛选到一批耐盐品种和盐敏感品种。王聪等[5]利用苗期致死浓度从15份菜用大豆品种筛选出2个耐盐品种以及2个盐敏感品种。刘光宇等[6]通过水培法,利用100 mmol∕L NaCl溶液模拟盐胁迫鉴定了29份大豆的耐盐性。张玉梅等[7]也利用NaCl致死浓度从244份野生大豆中鉴定到一批苗期耐盐种质资源。本研究对收集纯化的10份崇明岛地方菜用大豆品种[8]、3个引进常规品种以及4个自选育品种（种质）的发芽期和苗期耐盐性进行鉴定,并对其中10个品种进行结荚期耐盐性鉴定,旨在为菜用大豆耐盐品种的选育和耐盐机理的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

共选取了17份菜用大豆品种资源,包括10份从上海市崇明岛搜集纯化的地方菜用大豆品种资源‘黄牛踏扁’‘青牛踏扁’‘粗八月白’‘细八月白’‘骨粒青’‘乌大青’‘乌毛豆’‘绿皮豆’‘小安黄’和‘五早豆’,本课题组选育的4个菜用大豆新品种（种质）‘青酥五号’和‘VS13-2’‘VS11-5’和‘Z-7-5’,以及引进搜集的3个菜用大豆品种‘苏鲜四号’‘浙鲜豆五号’和‘八月白’。

1.2 试验方法

1.2.1 发芽期耐盐性鉴定

2016年2月16日对上述17个品种进行发芽期盐胁迫。以150 mmol∕L和200 mmol∕L NaCl溶液模拟盐胁迫,以清水为对照（CK）,每品种每处理选取100粒籽粒饱满、均匀一致的种子置于放有双层滤纸的培养皿中,3次重复。每个培养皿加NaCl溶液或清水20 mL,在25℃恒温箱中发芽。处理第2天在每个培养皿分别补充NaCl溶液或清水5 mL,随后每天补充3 mL,以保持发芽所需的水分。发芽6 d后,统计各品种的发芽率、发芽率-盐害率、胚根长度和胚根长-盐害率。发芽率=发芽种子数∕供试种子数×100%;发芽率-盐害率 =[发芽率（CK）- 发芽率（盐胁迫）]∕发芽率（CK）×100%;胚根长-盐害率 =[胚根长（CK）- 胚根长（盐胁迫）]∕胚根长（CK）×100%。

1.2.2 苗期耐盐性鉴定

2016年3月30日对上述17个品种进行苗期盐胁迫。挑选饱满均匀的种子播种于装有普通育苗基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1）的花盆（直径11 cm,高12 cm）中,每盆播12粒,每个品种播种18盆。试验在塑料大棚里进行,种子发芽后,正常水分管理,待子叶展开、对生真叶露出后间苗,每盆留长势较一致的幼苗5—6株。对生真叶完全展开后,盐胁迫分别浇灌150 mmol∕L和200 mmol∕L NaCl溶液,对照浇清水,每品种每处理6盆,将相同处理的花盆放置在一个底部不透水的塑料盆中（长×宽×高为50 cm×36 cm×10 cm）。每次每盆浇灌200 mL,每隔1 d浇1次,共浇灌6次。盐胁迫10 d后,测定各个品种的株高和叶绿素含量,并计算盐害率,盐害率计算公式参照发芽率-盐害率等。叶绿素含量的测定参照李合生等[9]的方法。

1.2.3 结荚期耐盐性鉴定

2016年8月4日选取10个品种进行结荚期耐盐性鉴定,挑选饱满均匀的种子种于装有普通栽培基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1,每盆添加颗粒缓释肥15 g）的花盆（口径28 cm,底径23 cm,高20 cm）中,每个花盆种10粒,每个品种6盆。试验在塑料大棚里进行,种子发芽后,正常水分管理。幼苗第一片三出叶展平时间苗,每盆留苗2株。分别在每个品种的盛花期用150 mmol∕L NaCl溶液进行盐胁迫,以浇清水为对照,盐胁迫和对照各3盆,每次每盆浇灌2 L,每隔1 d浇1次盐溶液,胁迫20 d。在各个品种的籽粒初熟期测定其有效分枝数、株高、单株荚数、产量及鲜籽粒百粒重,并计算相应的盐害率,盐害率计算公式参照发芽率-盐害率等。

1.2.4 菜用大豆苗期耐盐生理特性

2016年10月21日选耐盐性不同的4个品种‘浙鲜豆五号’‘VS13-2’‘苏鲜四号’和‘乌大青’进行苗期耐盐生理特性分析。采用育苗基质栽培,选取饱满的种子播种于高12 cm、直径11 cm的花盆中,每盆播12粒,每个品种30盆,每6盆放置在一个底部不透水的塑料盒中。正常水分管理,待子叶完全展开后,每盆选留长势一致的幼苗6棵。对生真叶展开时,每盆浇200 mmol∕L NaCl溶液200 mL,对照浇清水,盐胁迫和对照处理各15盆,每隔1 d浇1次。在盐胁迫第0、2、5、9、12天分别采取叶片,每次采集3盆,液氮速冻后存于-80℃冰箱中。样品用于测定SOD、ROD、CAT活性,可溶性蛋白含量及MDA含量。采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[9];过氧化物酶（ROD）活性测定参照陈建勋等[10]的方法;过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外分光光度法测定[11];可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[9];丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[9]。

1.3 数据分析

采用Excel 2010软件处理数据,用t-test进行成对显著性分析。采用DRS数据分析软件的“Duncan新复极差法”进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 菜用大豆发芽期耐盐性的鉴定

由表1可知,正常条件下不同品种间的发芽率有较大的差异,盐胁迫抑制了所有品种的发芽。150 mmol∕L NaCl处理6 d后,‘绿皮豆’和‘VS11-5’受盐害程度均超过32%,‘乌大青’和‘青酥五号’的盐害率分别为24.64%和24.34%;而‘五早豆’‘苏鲜四号’‘黄牛踏扁’‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’受盐害程度较低,分别为0.43%、2.22%、3.61%、4.51%和4.83%。200 mmol∕L NaCl处理6 d后,‘苏鲜四号’‘青酥五号’‘绿皮豆’和‘乌大青’的盐害率分别高达57.32%、50.60%、47.78%和45.05%;而‘骨粒青’‘VS13-2’‘五早豆’和‘浙鲜豆五号’受盐害程度较低,分别为5.26%、5.21%、6.25%和12.37%。

表1 盐胁迫对菜用大豆发芽率的影响Table 1 The effects of salt stress on germination rate of vegetable soybean cultivars

由表2可知,在正常条件下发芽6 d后,菜用大豆不同品种之间的胚根长度存在明显差异。150 mmol∕L NaCl处理6 d后,‘青牛踏扁’和‘粗八月白’受盐害程度较轻,分别为17.85%和22.60%,‘苏鲜四号’和‘浙鲜豆五号’的盐害率分别为33.59%和33.80%,其余大多数品种的胚根伸长受阻严重,盐害率超过50%。200 mmol∕L NaCl处理6 d后,仅‘粗八月白’和‘青牛踏扁’的盐害率较低,分别为42.88%和46.74%,其余品种胚根伸长受到严重抑制,盐害率为60%—80%。根据盐胁迫对菜用大豆的发芽率（表1）和胚根长度（表2）的影响,综合筛选获得了发芽期耐盐性较强的品种‘骨粒青’‘VS13-2’‘浙鲜豆五号’和‘青牛踏扁’,盐敏感品种‘乌大青’‘绿皮豆’‘苏鲜四号’和‘VS11-5’。

表2 盐胁迫对菜用大豆胚根长度的影响Table 2 The effects of salt stress onradicle length of vegetable soybean cultivars

2.2 菜用大豆苗期耐盐性的鉴定

由表3可知,与CK相比,17个品种的株高在不同程度上均受到了盐胁迫的抑制。150 mmol∕L NaCl处理10 d后,‘小安黄’‘绿皮豆’‘青牛踏扁’‘黄牛踏扁’‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’受到盐害的程度较轻,盐害率分别为4.39%、7.41%、7.91%、7.97%、8.08%和8.15%;而‘乌毛豆’‘粗八月白’‘苏鲜四号’和‘骨粒青’的株高受抑制程度较重,盐害率达到36.13%、19.01%、16.87%和15.91%。200 mmol∕L NaCl处理10 d后,‘乌毛豆’‘苏鲜四号’‘VS11-5’‘VS13-2’和‘绿皮豆’的盐害率分别高达35.62%、30.66%、27.62%和26.88%;而‘青牛踏扁’‘小安黄’和‘细八月白’受盐害程度较低,盐害率分别为13.53%、16.67%和18.14%。

表3 盐胁迫对菜用大豆株高的影响Table 3 The effects of salt stress on plant height of vegetable soybean cultivars

由表4可知,与CK相比,17个品种的叶绿素含量在盐胁迫10 d后均有不同程度的降低。150 mmol∕L NaCl处理10 d后,‘青牛踏扁’‘乌大青’‘粗八月白’和‘苏鲜四号’受盐害程度高,叶绿素含量明显降低,盐害率分别高达13.01%、9.99%、9.28%和9.20%,而‘骨粒青’‘浙鲜豆五号’和‘乌毛豆’的盐害率较低。200 mmol∕L NaCl处理10 d后,‘青牛踏扁’‘乌大青’‘八月白’和‘粗八月白’的盐害率分别高达15.31%、13.83%、13.72%和12.91%,而‘浙鲜豆五号’‘乌毛豆’和‘骨粒青’受盐害程度较轻。因此,综合考虑各品种在盐胁迫10 d后的株高和叶绿素含量的变化,鉴定获得苗期耐盐性品种‘浙鲜豆五号’‘五早豆’‘骨粒青’和‘VS13-2’,盐敏感品种‘乌大青’‘苏鲜四号’和‘黄牛踏扁’。

表4 盐胁迫对菜用大豆叶片中叶绿素含量的影响Table 4 The effects of salt stress on chlorophyll content in leaf of vegetable soybean cultivars

2.3 菜用大豆结荚期耐盐性鉴定

由表5可知,150 mmol∕L NaCl胁迫20 d后,10个品种的株高和有效分枝数均有不同程度的减少,以‘苏鲜四号’‘乌大青’和‘青牛踏扁’受盐害程度较重,‘骨粒青’‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’受盐害程度较轻。由表6可知,盐胁迫20 d后,各品种的单株荚数、产量和鲜籽百粒重也有不同程度的降低,其中,‘细八月白’‘VS13-2’‘骨粒青’和‘浙鲜豆五号’的盐害率较低,而‘乌大青’‘苏鲜四号’‘绿皮豆’和‘五早豆’的盐害率较高。

表5 盐胁迫对菜用大豆生长的影响Table 5 The effects of salt stress on plant growth of vegetable soybean cultivars

综合评价各品种发芽期、苗期及结荚期的耐盐性,鉴定得到3个耐盐品种‘浙鲜豆五号’‘VS13-2’和‘骨粒青’,3个盐敏感品种‘乌大青’‘苏鲜四号’和‘绿皮豆’。

2.4 盐胁迫对菜用大豆苗期叶片抗氧化酶系统的影响

对‘浙鲜豆五号’‘VS13-2’‘苏鲜四号’和‘乌大青’进行苗期盐胁迫。由表7可知,‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’的ROD活性在盐胁迫2 d和5 d显著高于CK,12 d后又显著降低;‘苏鲜四号’和‘乌大青’的ROD活性在盐胁迫5 d时显著高于CK,9 d和12 d又显著降低。盐胁迫下,‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’的ROD活性明显高于‘苏鲜四号’和‘乌大青’,以‘浙鲜豆五号’的ROD活性最高。与CK相比,‘浙鲜豆五号’的CAT活性在盐胁迫2 d和5 d时显著升高,而‘VS13-2’的CAT活性在盐胁迫5 d、9 d和12 d时显著降低,‘苏鲜四号’和‘乌大青’的CAT活性在盐胁迫2 d时显著升高,在5 d和9 d时又显著降低。‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’的CAT活性在盐胁迫5 d、9 d和12 d时明显高于‘苏鲜四号’和‘乌大青’。与CK相比,这4个品种的SOD活性在盐胁迫早期变化不明显,在9 d和12 d后显著降低。‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’在盐胁迫9 d和12 d时明显高于‘苏鲜四号’和‘乌大青’。

表6 盐胁迫对菜用大豆鲜荚产量的影响Table 6 The effects of salt stress on fresh pod yields of vegetable soybean cultivars

表7 盐胁迫对菜用大豆叶片抗氧化酶（POD、CAT、SOD）活性、可溶性蛋白和MDA含量的影响Table 7 The effects of salt stress on activities of POD,CAT and SOD,on contents of soluble protein and MDA in leaf of vegetable soybean cultivars

由表7还可以看出,与CK相比,这4个品种的可溶性蛋白含量在盐胁迫2 d与5 d时显著增加,随着胁迫时间的延长又有不同程度的降低,在12 d后明显低于CK。盐胁迫下,‘VS13-2’的可溶性蛋白含量高于‘浙鲜豆五号’‘苏鲜四号’和‘乌大青’。此外,这4个品种的MDA含量随着盐胁迫的进行明显高于对照。盐胁迫下,‘苏鲜四号’和‘乌大青’的MDA含量明显高于‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’,在盐胁迫12 d时,‘乌大青’的MDA含量最高,‘苏鲜四号’次之。

3 讨论与结论

植物的耐盐性评价指标可以综合为两类:一类是表型指标,即生长指标,包括盐害指数、生物量和产量等;另一类是生理指标,主要包括Na+和Cl-等盐离子的含量与分布、细胞质膜透性及抗氧化酶活性等。大豆属陆生植物,本试验利用普通栽培基质培育菜用大豆,浇灌NaCl溶液模拟盐胁迫,此方法与水培[6-7,12]或蛭石栽培[8,13]相比,更接近菜用大豆的实际生长环境,能更好地反映植株在盐碱地的生长状态,且操作简便、易于管理。本研究利用150 mmol∕L和200 mmol∕L NaCl溶液对17个菜用大豆品种进行发芽期和幼苗期耐盐性鉴定,并以单株有效分枝数、鲜荚产量和鲜籽粒百粒重为指标,鉴定了其中10个品种的结荚期耐盐性。综合评价筛选出3个耐盐品种‘浙鲜豆五号’‘VS13-2’和‘骨粒青’,3个盐敏感品种‘乌大青’‘苏鲜四号’和‘绿皮豆’,为筛选创制菜用大豆耐盐种质和探讨耐盐机理奠定了良好的物质基础。

在正常条件下,植物体内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生与清除处于动态平衡状态。当植物遭遇盐胁迫时,动态平衡会被打破,导致膜质过氧化、叶绿素降解,甚至植株死亡[3,14-15]。大豆遭遇盐胁迫时,可以通过调节Na+的吸收和转运[15-17]以及Cl-的排出[18-19]来降低植株地上部Na+和Cl-的含量,也可以利用活性氧清除系统来清除ROS,减少细胞膜系统的损伤[8,15,20-21]。本试验对筛选出的耐盐品种‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’及盐敏感品种‘苏鲜四号’和‘乌大青’进行苗期盐胁迫,结果表明:‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’能够迅速响应盐胁迫,维持较高的ROD和CAT等抗氧化酶活性,使ROS的产生和清除维持在一个相对较稳定的状态,降低细胞膜质的过氧化速度,减缓MDA含量的积累,从而减少ROS对细胞的伤害,进一步从生理角度说明‘浙鲜豆五号’和‘VS13-2’的耐盐性较强。