腰痛片中香豆素类成分含量测定方法优化

王艳萍，陈雪琴

（陕西省商洛市药品检验所，陕西商洛 726000）

腰痛片为2015版中国药典收载的成方制剂[1]，主要由杜仲叶、补骨脂、续断、当归、白术、牛膝、肉桂、乳香、狗脊、赤芍、泽泻、土鳖虫等十二味中药组成，具有补肾活血，强筋止痛之功效[2]。用于肾阳不足、淤血阻络所致的腰痛及腰肌劳损等症[1,3]。补骨脂作为其强筋骨的主要组方，对其有效成分进行快速测定就显得很有必要。陈莹等[4]综述补骨脂化学成分主要有香豆素类、单萜类、黄酮类以及甾醇类，而香豆素类组分主要是补骨脂素、异补骨脂素和甲氧补骨脂素。2010版中国药典一部腰痛片中补骨脂含量测定方法为高效液相色谱法[5]，流动相采用的是甲醇-磷酸氢二钠（0.1 mol·L-1）溶液（用磷酸调节 pH 值至7），二者比例为35：65，测定处方中补骨脂有效成分补骨脂素和异补骨脂素。然而，采用该流动相测定样品时，出峰时间大多在50 min以后，时间太长。同时，由于该流动相中引入了盐溶液，整个流路系统容易堵塞，从而影响工作进度[6]。基于此，本文对中药复方腰痛片中补骨脂素和异补骨脂素含量测定方法进行优化，以期建立一种快速有效的测定腰痛片中有效成分的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪，购自日本岛津公司；BS224S电子分析天平（d=0.01 mg）和BT125D电子分析天平（d=0.01 mg），购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-1801/1801PC紫外可见分光光度计，购自上海谱析仪器有限公司；SCS-1B纯水机，购自北京先锋威驱技术开发公司；KQ-400DE型数控超声波清洗仪，购自昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂

色谱级乙腈、甲醇（美国Sigma-Aidrich公司），磷酸氢二钠（天津市百世化工有限公司）、磷酸（天津市天力化学试剂有限公司）、甲醇（天津市红岩化学试剂厂）等均为优级纯；补骨脂素对照品（中国食品药品检定研究院，110739-201115）和异补骨脂素对照品（中国食品药品检定研究院，110738-200308）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

1）药典规定条件

采用 Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-磷酸氢二钠（0.1mol·L-1）溶液（用磷酸调节 pH 值至 7）（35：65）；柱温为 35 ℃；检测波长246 nm。理论板数按异补骨脂素峰计算应不低于5 000[1]。

2）改进条件

采用 Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-甲酸（0.1）%水溶液，采用梯度洗脱：0～5 min，65：35；5～20 min；55：45；20～35 min，45：55；35 min 以后，35：65；柱温：35℃；检测波长246 nm。理论板数按异补骨脂素峰计算应不低于5 000。

1.3.2 待测溶液的制备

1）对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素对照品7.40 mg，异补骨脂素对照品6.60 mg，加甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中。制成质量浓度为补骨脂素 37 μg·mL-1；异补骨脂素 33 μg·mL-1对照品溶液[1,7]。

2）供试样品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取样品粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，冷浸1 h，超声处理（功率400 W，频率50 kHz）45 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1,7]。

1.3.3 重复性考察

取1.3.2步骤2）样品共6份，精密称定，分别按1.3.2项下供试样品制备方法制备样品溶液，按上述色谱条件进行重复测定，考察该方法的重现性。

1.3.4 线性关系考察

分别精密吸取质量浓度为37 μg·mL-1的补骨脂素和33 μg·mL-1的异补骨脂素对照品溶液各 1、5、10、15、20 mL 置于 25 mL 容量瓶中加甲醇定容至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液10 μL，在1.3.1色谱条件下考察其线性关系。

1.3.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，考察该方法的精密度。

1.3.6 稳定性实验

取同一样品溶液分别在 0，2，4，6，8，10，12 h测定其含量，考察该方法一定时间内的稳定性。

1.3.7 加样回收实验

取已测得含量的样品1.0 g，共6份，分别精密加入补骨脂素对照品与异补骨脂素对照品。参照1.3.2项下供试品溶液同法制备，按1.3.1色谱条件进行测定，考察该方法的加样回收率。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 重复性实验

按照1.3.1色谱条件和样品制备方法进行重复实验，结果如表1所示。从表1可见，补骨脂素含量的RSD为0.98%；异补骨脂素含量的RSD为1.31%，结果表明样品重复性良好。

表1 腰痛片补骨脂素和异补骨脂素的重复性

2.1.2 线性关系

精密吸取上述对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下测定峰面积，以峰面积（Y）对对照品进样量（X，μg）做标准曲线，得回归方程Yb=0.000 118 358X-0.344 727，r2=0.999 9；Yy=0.000 120 346X-0.944 223，r2=0.9993，表明补骨脂素对照品的进样量在0.37～7.40 μg，异补骨脂素对照品的进样量在0.33～6.60 μg，与峰面积线性关系良好。

2.1.3 精密度

由表2可见，精密吸取对照品溶液10 μL，连续进针6次，考察其峰面积，结果6次补骨脂素峰面积的RSD为0.96%，异补骨脂素峰面积的RSD为0.33%，表明该方法的精密度良好。

2.1.4 稳定性实验

由表3可见，12 h内供试品溶液具有良好的稳定性，补骨脂素的RSD为0.78%，异补骨脂素的RSD为0.64%，说明该方法在12h内较稳定。

2.1.5 加样回收实验

由表4可以看出，补骨脂素平均加样回收率为100.0%，RSD为2.04%；异补骨脂素97.3%，RSD为0.81%，表明该方法回收率良好。

表2 腰痛片补骨脂素和异补骨脂素的精密度

表3 腰痛片补骨脂素和异补骨脂素的稳定性

表4 腰痛片补骨脂素和异补骨脂素加样的回收率

2.2 色谱条件优化

按照药典规定的色谱条件和优化之后的色谱条件，分别各进样一次，测得结果如图1所示。从图1中可以看出，色谱条件优化之后补骨脂素和异补骨脂素色谱峰与其它杂质峰分离效果较好，而且在20 min内即可完成，相比药典规定的色谱条件出峰时间大为缩短。

图1 腰痛片中补骨脂素和异补骨脂素HPLC图

2.3 样品含量的测定

分别测定6份样品当中补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果见表5。由表5可见，该6批次腰痛片中补骨脂素含量均高于0.37 mg·g-1，异补骨脂素含量均高于 0.35 mg·g-1， 二者 RSD 分别 为 1.04%和 1.28%。

表5 腰痛片中补骨脂素和异补骨脂素的含量

3 讨论与结论

采用 C18柱，以甲醇-甲酸（0.1%）水溶液作为流动相， 采用梯度洗脱：0～5 min，65：35；5～20 min；55：45；20～35 min，45：55；35 min 以后，35：65；检测柱温和波长分别为35℃和246 nm。

通过对药典规定的色谱条件加以优化，不仅可以大大缩短含量分析检测时间，而且还能够在很大程度上缓解盐溶液等有腐蚀性的流动相对仪器管路的腐蚀与阻塞，这对提高操作效率和仪器使用率大有帮助[8-9]。本研究结果表明，优化后的方法结果准确、灵敏度高，节约时间，重现性好，简便可行，易于操作。