黏蛋白-4在膀胱癌中的表达及作用机制

刘 远，劳辉恒，李宇同

1广东省开平市中心医院泌尿外科，广东 开平 529300；2暨南大学附属第一医院泌尿外科，广东 广州 510507

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，是男性第4大常见癌症，在全球排名第9[1-2]。男性比女性膀胱癌发病率要高[3]。确诊时，90%的膀胱癌是尿路上皮癌，其余10%多数是鳞状细胞癌和腺癌[4]。许多危险因素导致膀胱癌的恶性转化和进展，包括吸烟、大量饮酒和职业暴露于多环芳烃或芳香胺[5]。粘蛋白存在于由腺上皮分泌的粘液中，起着润滑和保护人体内各种官腔的作用，还参与细胞间的粘附、信号转导和免疫反应[6-7]。黏蛋白-4（mucin-4）涉及多种人类癌症，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、胆囊癌、唾液腺癌、前列腺癌、胆道癌和卵巢癌等[8-10]。有研究发现mucin-4在膀胱尿路上皮癌组织中表达是增加的[11]，但是关于mucin-4在膀胱癌中的具体作用机制尚未阐明。本研究为探究mucin-4在膀胱癌中的表达及作用机制做了如下探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择广东省两家三甲医院泌尿外科2016年1月～2017年6月期间收集的膀胱癌标本115例，同时选取距离肿瘤边缘＞2 cm的癌旁组织作为对照。所有患者已经病理科明确诊断。

纳入标准：所有患者符合《2005年欧洲泌尿外科会议膀胱癌诊断治疗纲要》[12]。排除标准：严重电解质紊乱者；严重肝肾功能不全、心功能不全、严重感染者；神志不清，无法配合者。所有受试者已获得知情同意，并已通过医院伦理会的批准。

1.2 研究方法

1.2.1 收集组织标本 收集手术过程中经病理确诊的膀胱癌组织，和距离肿瘤边缘＞2 cm（镜下未见癌细胞）的癌旁组织，大小为0.5 cm×0.5 cm，将组织置于装入冻存管，置于液氮罐中保存。

1.2.2 RNA的提取和mucin-4 mRNA的QRT-PCR测定 采用Trizol（Invitrogen, Life Technologies）法从组织内提取总RNA，然后反转录成cDNA（PrimeScript RT Reagent Kit ，Takara）。用 QRT-PCR法（SYBR Premix Ex Taq Kit，Takara， 7500 Real-time PCR system ，Applied Biosystems）测定血清mucin-4 mRNA的表达，用GAPDH作为内参。

使用公式2–ΔΔCt计算mucin-4 mRNA相对表达量。

1.2.3 细胞培养 用含有10%的胎牛血清，1%链霉素-青霉素双抗的DMEM培养T24细胞系（膀胱癌细胞系）。根据细胞生长情况每1～3 d更换1次培养基。

1.2.4 Western blot法 从膀胱癌细胞中提取总蛋白。蛋白质通过SDS-PAGE凝胶电泳分层，转移到硝酸纤维素膜上。 用5%脱脂牛奶封闭30 min后，将膜与抗mucin-4抗体（1:500；Santa Cruz Biotech）在4 ℃孵育过夜，用TBST（Tris缓冲盐水Tween 20）洗涤3次，与过氧化物酶标记的第二抗体在室温下孵育1 h，用TBST洗涤3次。该膜用增强的化学发光显影。结果用图像站（UVI，Cambridge，UK）拍摄。

1.2.5 RNA干扰实验 严格按照说明书（广州瑞博siRNA使用说明（2009-08））进行操作。设置mucin-4过表达模型（mucin-4 mimic），空白对照（mucin-4 mimic control）；mucin-4敲除模型（siRNA），空白对照（siRNA control）。分别观察mucin-4过表达或者敲除时T24细胞增殖和凋亡情况。

1.2.6 细胞增殖和细胞凋亡实验 采用MTT比色法判断细胞增殖情况；采用Caspase 3 ELISA试剂盒（R&D, Minneapolis, MN, USA）判断细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差表示; 计量资料比较用独立样本的t检验。计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mucin-4在膀胱癌组织和癌旁组织的表达

膀胱癌组织mucin-4的相对表达水平明显高于正常膀胱组织，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 mucin-4在膀胱癌组织组织和癌旁组织的表达

2.2 mucin-4的表达水平与膀胱癌临床相关参数的关系

mucin-4的表达水平与膀胱癌的肿瘤大小、有无淋巴结转移，以及TNM分期有关（P＜0.05）；肿瘤直径大于5 cm组mucin-4的表达水平高于肿瘤直径小于5 cm组；有淋巴结转移的膀胱癌组mucin-4的表达水平高于无淋巴结转移的膀胱癌组；Ⅲ+Ⅳ期膀胱癌组mucin-4的表达水平明显高于Ⅰ+Ⅱ期膀胱癌，差异具有统计学意义（P＜0.05）。mucin-4的表达水平与膀胱癌患者的年龄、性别无关（P＞0.05，表1）。

表1 mucin-4的表达水平与膀胱癌临床相关参数的关系

2.3 mucin-4过表达或者敲除时T24细胞增殖和凋亡情况

mucin-4过表达时，膀胱癌细胞（T24细胞系）的增殖是增加的，凋亡是减少的；而mucin-4敲除时，膀胱癌细胞（T24细胞系）的增殖是减少的，凋亡是增加的（图2）。

图2 mucin-4过表达或者敲除时T24细胞增殖和凋亡情况（×40)

3 讨论

全球流行病学调查数据显示，全世界每年有超过357 000例膀胱癌新发病例和超过130 000例死于膀胱癌的患者，膀胱癌是男性死亡的主要原因之一[13]。在欧洲，2012年新诊断的膀胱癌新发病例为151 797例[14]。在发展中国家，人口老龄化和烟草使用量高使得膀胱癌的发病率显著高于发达国家[15]。膀胱癌确切的发病机制尚不清楚，有许多国外文献报道mucin-4参与多种肿瘤的发生发展过程，但是关于mucin-4在膀胱癌中的的作用，国内文献鲜有报道。

本研究发现，膀胱癌组织mucin-4的相对表达水平明显高于正常膀胱组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这与Torres等[16]研究结果一致，提示mucin-4可能在膀胱癌的发生发展中起着重要作用。进一步相关分析显示，mucin-4的表达水平与膀胱癌的肿瘤大小、有无淋巴结转移以及TNM分期有关（P＜0.05）。细胞实验结果发现mucin-4可以促进膀胱癌细胞增殖，抑制凋亡。有研究发现，沉默mucin-4的表达导致胰腺肿瘤生长和转移减少[17]。这与本研究结果相类似。但是Liu等[18]却发现mucin-4在乳腺肿瘤转移中上调，但在原发肿瘤中不上调。这可能与不同类型的癌细胞有关。Torres等[16]研究也认为mucin-4对胰腺癌细胞的增殖、分化、以及转移中起着重要作用。温雯静[11]等对78例膀胱尿路上皮癌患者进行研究，也发现mucin-4蛋白在膀胱癌细胞中的阳性率明显高于膀胱正常黏膜，与患者年龄、性别、肿瘤数目无关。但与温的研究结果不同，本研究发现mucin-4的表达水平与膀胱癌的肿瘤大小具有相关性。这可能与病例数、肿瘤分期不同有关。另外温雯静的研究采用的是免疫组化等方法，与本研究的方法也有所差异。上述原因都可能造成研究结果的不一致。

结合细胞实验和统计学分析结果，关于mucin-4在膀胱癌中的可能作用机制有如下几点：mucin-4能破坏肿瘤细胞中可形成粘连的细胞间相互作用[19]。因此，mucin-4可以促使肿瘤细胞从原发肿瘤分离，促进侵袭和转移。肿瘤细胞中粘附连接和钙粘蛋白相互作用的破坏消除了这些细胞中的接触抑制，导致促进细胞增殖的Erk途径的信号传导增加。因此，mucin-4可以通过间接或者直接的抗粘附机制来促进肿瘤细胞生长。另一方面，mucin-4还可以促进促凋亡蛋白Bad的磷酸化和失活，促进存活蛋白Bcl-xl的表达，从而进一步促进膀胱癌细胞的增殖，抑制其凋亡[20]。同时，MUC4还可以通过介导ErbB2的酪氨酸发生磷酸化，进而影响细胞的凋亡与分化[21]。

综上所述，mucin-4在膀胱癌的发生发展中起着重要作用，其表达水平对膀胱癌的严重程度及预后情况具有一定的参考价值。本次研究也存在一定的不足之处：样本量太小，应适当增加样本量；缺乏体内实验证据，应完善动物实验。