莫诺苷通过AMPKα/PGC-1α/GLUT4通路对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的保护作用①

李 霞 张铁军 封亚丽

(河北省中医院心内科,石家庄 050011)

心血管并发症是糖尿病患者发病和死亡的主要原因，糖尿病性心肌病是糖尿病主要的心血管并发症之一，其主要特征表现为心脏舒张功能障碍，心肌组织病变，氧化应激及炎症反应增强等[1,2]。由于糖尿病心肌病病因及发展的多因素性，目前还没有专门针对糖尿病心肌病的有效治疗方法。寻找有效的糖尿病性心肌病治疗方法对人类健康医疗卫生事业具有重要意义。莫诺苷(化学结构式见图1)是山茱萸和接骨木的主要活性物质，属于环烯醚萜苷类，具有抗病毒、抗氧化、抗癌及肝脏保护等活性，有利于神经系统、心血管系统和消化系统[3,4]。本研究主要目的是利用高糖饮食联合链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导糖尿病大鼠模型，再对糖尿病大鼠进行冠状动脉结扎建立糖尿病缺血再灌注模型，通过检测大鼠心脏功能指标、心肌梗死面积、心肌损伤标记蛋白、氧化应激、炎症反应及AMPKα/PGC-1α/GLU4通路探究莫诺苷对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 60只体重200～300 g雄性SD大鼠来源于中国科学院实验动物中心。莫诺苷和STZ购自Sigma公司。ELISA试剂盒购自RD公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondiadehyde,MDA)检测试剂盒购自江苏碧云天公司。抗肌红蛋白(Myoglobin,Mb)抗体、抗肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)抗体、抗肌钙蛋白I(Troponin-I,cTn I)抗体、抗AMPKα1抗体、抗PGC-1α抗体和抗GLUT4抗体购自Abcam公司。

图1 莫诺苷化学结构式Fig.1 Chemical structure of morroniside

1.2方法

1.2.1动物分组及模型建立 60只大鼠高糖饲养8周后，一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，72 h后血糖高于16.7 mmol/L为建模成功。随机挑选40只糖尿病大鼠分为4组：对照组(DM)；对照加药组(DM+莫诺苷)；模型组(I/R+DM)；加药组(I/R+DM+莫诺苷)。对照加药组和加药组每天100 mg/kg 莫诺苷口服喂养大鼠，共25 d。对照组和模型组用生理盐水代替莫诺苷。模型组和加药组进行冠状动脉结扎术建立缺血再灌注模型，对照组和对照加药组进行假手术。

1.2.2苏木素伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色 颈椎脱臼法处死大鼠后取左心室心肌组织用PBS清洗8次，去掉坏死组织及血凝块。用4% 的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脱水。去除酒精脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋。切片后按照HE染色液说明书进行染色。光镜下观察心肌损伤情况。

1.2.3ELISA检测 收集各组待测大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书进行检测，样品加入反应孔后37℃孵育45 min后用洗涤液洗涤4次，然后加入生物素标记的抗体37℃反应30 min，洗涤后加链霉亲和素-HRP 混匀37℃反应30 min。最后加入显色剂避光显色15 min后加终止液终止反应，450 nm处检测吸光值。

1.2.4蛋白印迹 首先用PBS将待测组织细胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解进行总蛋白提取，100℃变性5 min。然后等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，经5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育，第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1莫诺苷对糖尿病缺血再灌注大鼠心脏功能的影响 通过检测各项心脏功能指标和心肌梗死面积，探究莫诺苷对糖尿病缺血再灌注大鼠心脏功能的影响。图2A～C显示，糖尿病大鼠在缺血再灌注后平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP)，心率(Heart rate,HR)和左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)明显降低(P<0.05)。莫诺苷处理会提高糖尿病缺血再灌注大鼠MAP、HR和LVSP水平(P<0.05)。由图2D可知，糖尿病缺血再灌注大鼠心肌梗死面积明显大于糖尿病大鼠(P<0.05)。莫诺苷可减少糖尿病缺血再灌注大鼠心肌梗死面积(P<0.05)。上述结果表明，莫诺苷会提高糖尿病缺血再灌注大鼠心脏功能。

2.2莫诺苷对糖尿病缺血再灌注大鼠心肌组织病变的影响 通过HE染色观察莫诺苷对糖尿病缺血再灌注大鼠心肌组织病变的影响。如图3所示，DM组大鼠心肌组织出现细胞排列轻度紊乱，少数心肌纤维断裂；DM+莫诺苷组大鼠心肌组织结构致密整齐，心肌纤维完整，无心肌纤维断裂；I/R+DM模型组大鼠心肌组织出现严重的细胞排列紊乱，细胞肿胀，多数心肌纤维断裂；I/R+DM+莫诺苷加药组较I/R+DM组心肌组织病变程度明显减轻。由此可见， 莫诺苷可改善糖尿病大鼠缺血再灌注导致的心肌组织病变。

图2 心脏功能指标(A～C)和心肌梗死面积(D)Fig.2 Cardiac function index (A-C) and myocardial infarct area (D)Note:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

2.3莫诺苷对糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的心肌损伤标记蛋白表达的影响 为分析莫诺苷对缺血再灌注诱导的心肌损伤的影响，蛋白印迹检测心肌损伤标记蛋白Mb、CK-MB和cTn I的表达。由图4可知，缺血再灌注会导致Mb、CK-MB和cTn I表达升高(P<0.05)。莫诺苷处理可降低缺血再灌诱导的Mb、CK-MB和cTn I表达的增强(P<0.05)。上述结果表明，莫诺苷可抑制糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的心肌损伤标记蛋白Mb、CK-MB和cTn I表达的上升。

2.4莫诺苷可降低糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的炎症反应 通过ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，分析莫诺苷对缺血再灌注诱导的炎症反应的影响。图5显示，I/R+DM模型组促炎因子TNF-α和 IL-6水平明显高于DM组，抗炎因子IL-10水平明显低于DM组(P<0.05)。与I/R+DM模型组相比，加药组TNF-α和 IL-6水平明显下降，IL-10水平明显升高(P<0.05)。由此可见，莫诺苷处理可减弱糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的炎症反应的升高。

2.5莫诺苷会抑制糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的氧化应激 利用ELISA检测SOD和MDA水平探究莫诺苷对缺血再灌注诱导的氧化应激的影响。如图6所示，I/R+DM模型组SOD水平明显低于DM组，MDA水平则明显高于DM组(P<0.05)。与I/R+DM模型组相比，莫诺苷处理可降低缺血再灌注诱导的SOD水平的下降和MDA水平的升高(P<0.05)。以上结果说明，莫诺苷会抑制糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的氧化应激。

图3 HE染色检测心肌组织病变Fig.3 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining

图4 蛋白印迹检测心肌损伤标记蛋白表达Fig.4 Expression of myocardial injury marker proteins was detected by Western blotNote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

图5 ELISA检测炎症因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

图6 ELISA检测氧化应激指标Fig.6 Indexes of oxidative stress were tested by ELISANote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

图7 蛋白印迹检测AMPK通路相关蛋白表达Fig.7 Expression of AMPK pathway related proteins was detected by Western blotNote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

2.6莫诺苷对AMPK通路相关蛋白表达的影响 为进一步分析莫诺苷保护糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的分子机制，蛋白印迹检测AMPK通路相关蛋白AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表达。图7显示，I/R+DM模型组AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表达水平明显低于DM组(P<0.05)。加药组AMPKα1、PGC-1α和GLUT4蛋白水平明显高于I/R+DM模型组。由此可见，莫诺苷可降低缺糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表达的增强。

3 讨论

目前，糖尿病心血管并发症的传统治疗药物如抗糖尿病药剂，以及细胞和线粒体脂肪酸吸收抑制剂等主要功效在于保持心脏代谢平衡，但还不能改善糖尿病心肌病其他的症状[5]。许多植物天然产物由于其多方面的生物活性而受到越来越多的关注。

心脏功能障碍是糖尿病大鼠心肌损伤的主要病征之一。多种天然产物具有提高心脏功能的作用。Diao等[6]发现在糖尿病大鼠缺血再灌注模型中，落新妇苷处理可提高LVSP水平，降低心肌梗死面积，改善心肌损伤组织病理学变化。据报道在糖尿病大鼠中，绿茶的主要活性物质表没食子儿茶素没食子酸酯可抑制缺血再灌注导致的LVSP水平的降低，减少心肌梗死面积[7]。有数据显示莫诺苷具有改善糖尿病大鼠肝脏组织病变的作用[8]。有研究发现在局灶性脑缺血再灌注大鼠模型中，莫诺苷可降低脑梗死面积[9]。本文结果显示，莫诺苷会抑制糖尿病大鼠缺血再灌注导致的MAP、HR和LVSP水平的降低和心肌梗死面积的增大，提高心脏功能，改善心肌组织病变。

大量研究表明许多天然植物提取物可抑制心肌损伤标记物的释放。有数据表明在糖尿病大鼠中，山柰黄酮醇可减轻缺血再灌注诱导的CK-MB水平的增加[10]。有研究发现在糖尿病大鼠缺血再灌注模型中没食子酸具有降低CK-MB和cTn I水平的功效[11]。据报道在糖尿病大鼠中，淫羊藿苷可减轻缺血再灌注诱导的心肌受损，抑制CK-MB活性的增强[12]。Suchal等[13]发现在糖尿病缺血再灌注大鼠模型中，芒果苷可抑制CK-MB活性的增强。本研究结果表明，莫诺苷会减弱糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的Mb、CK-MB和cTn I表达的上升。

炎症反应的增强是各类疾病的普遍现象，越来越多的研究表明多种植物提取物具有抗炎的作用。有数据显示毛地黄黄酮会减少糖尿病大鼠缺血再灌注导致的TNF-α和 IL-6的释放[14]。Duan等[15]发现竹节人参皂甙Ⅳa会减弱糖尿病大鼠缺血再灌注引起TNF-α和 IL-6水平的升高。据报道莫诺苷可降低糖尿病大鼠肾脏的炎症反应[16]。有研究发现莫诺苷可抑制大脑局部缺血大鼠IL-1β的释放，减轻血脑屏障损伤导致的炎症反应[17]。本文结果显示，在糖尿病大鼠中，莫诺苷会抑制缺血再灌注引发的TNF-α和 IL-6水平的上升及IL-10水平的下降。

氧化应激是许多疾病的主要特征之一，许多植物提取物具有降低氧化应激的功效。Silawat等[18]发现诃子次酸会减弱糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的MDA水平的升高和SOD活性的降低。据报道毛地黄黄酮可抑制糖尿病大鼠缺血再灌注诱导的心脏MDA水平的上升[19]。有研究发现人参皂苷Rb1会减弱糖尿病大鼠中缺血再灌注引发的MDA水平的升高和SOD活性的下降[20]。有研究表明莫诺苷可降低糖尿病大鼠MDA水平，增强SOD活性[21]。据报道莫诺苷会抑制局灶性脑缺血导致MDA水平的上升和SOD活性的降低[22]。本研究结果表明，在糖尿病缺血再灌注大鼠中，莫诺苷可提高SOD活性，降低MDA水平。

AMPK/PGC-1α/GLU4信号通路在糖尿病性心肌病中起着重要的调控作用[23]。有研究发现来源于太白楤木的总皂苷可通过激活AMPK信号通路改善缺血再灌注诱导的心肌损伤[24]。有数据表明在糖尿病大鼠中，紫铆黄酮可增强AMPK表达，通过AMPK通路减轻缺血再灌注导致的心肌损伤[25]。据报道姜黄素衍生物B06可降低高脂饮食大鼠和糖尿病大鼠AMPKα的表达，通过AMPK信号通路改善糖尿病心肌损伤[26]。Chen等[27]发现小檗碱可通过激活AMPK降低糖尿病大鼠缺血再灌注引起的心脏功能受损程度。本文结果显示，莫诺苷可抑制AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表达的增强，改善糖尿病缺血再灌注大鼠心肌损伤。

本研究表明，在糖尿病缺血再灌注大鼠中，莫诺苷可提高MAP、HR和LVSP水平；降低心肌梗死面积；改善心肌组织病变；减弱Mb、CK-MB和cTn I表达；抑制TNF-α和 IL-6水平的上升及IL-10水平的下降；提高SOD活性，降低MDA水平；增强AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表达。综上所述，莫诺苷可通过激活AMPKα/PGC-1α/GLUT4通路减轻糖尿病大鼠缺血再灌注心肌损伤。下一步计划研究莫诺苷对其他糖尿病并发症的影响，为开发糖尿病并发症治疗策略奠定基础。