蚕蛹壳聚糖季铵盐的制备及其性能检测

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(重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460)

0 引言

蚕蛹壳聚糖为α-型甲壳素脱乙酰衍生物，结晶度较低，因此溶解性强于虾蟹壳聚糖，蚕蛹壳聚糖在稀酸溶液溶解后，所形成聚合物具有较大透气性和透湿性[1-5]。蚕蛹壳聚糖溶解性虽强于虾蟹壳聚糖，但因其壳聚糖分子结构上的功能基团以及分子内、分子间的氢键使它的结构紧密，且仅能溶解在酸性溶液中，水溶性较差，这制约了蚕蛹壳聚糖的应用，因此有必要对蚕蛹壳聚糖进行改性，以达到利用其生物活性和生理活性的目的。

壳聚糖分子中存在着羟基和氨基的特征结构，这有利于对它进行物理和化学改性，引入化学基团以改善壳聚糖的物理和化学性质。季铵盐是铵离子中的四个氢原子都被烃基取代而生成的化合物，季铵盐可以通过胺与卤代烃反应制取，它易溶于水且有较强的抗菌性能，因其特有的性能被广泛用于各种化合物改性中[6-10]。目前季铵盐类消毒剂被广泛应用于医疗卫生、生物制剂以及农业中。利用季铵盐对壳聚糖进行改性，若两者结合既能保留季铵盐的水溶性好的特点，又能增强两者都具有的抗菌性能，这样的化合物将具有更好的应用前景。本研究对蚕蛹来源的壳聚糖进行季铵盐化改性，并对得到的壳聚糖衍生物进行性能检测，以初步探讨蚕蛹壳聚糖季铵盐的性能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蚕蛹壳聚糖(脱乙酰度70.02%，实验室自制)，LB培养基、琼脂粉，2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTAC)、铬酸钾、硝酸银、无水乙醇、丙酮、异丙酮及其它药品均为市购分析纯，金黄色葡萄糖球菌、大肠杆菌。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕蛹壳聚糖季铵盐的合成

制备蚕蛹壳聚糖季铵盐[11]，称取蚕蛹壳聚糖10g，加入有500mL异丙醇三口烧瓶中，在温度(85± 5)℃条件下水浴加热，并进行50r/min搅拌。将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTAC)配置成n(EPTAC)∶n(-NH2)=8∶1的水溶液，用流滴管加入三口烧瓶中，反应8h后固液分离。将所得到的固体用无水乙醇洗涤3次，再用3倍体积丙酮沉淀分离，沉淀物再用丙酮洗涤3次。真空抽滤得到固相产品，置于(45±1)℃的烘箱中烘干，得到的黄色固体产品即为蚕蛹壳聚糖季铵盐。

1.2.2 蚕蛹壳聚糖季铵盐的取代度测定

称取一定量蚕蛹壳聚糖季铵盐置于盛有一定量1%醋酸溶液中，以加快蚕蛹壳聚糖季铵盐的溶解。搅拌至蚕蛹壳聚糖季铵盐完全溶解后，以铬酸钾溶液作为显色指示剂，加入0.01 moL/L的AgNO3标准滴定液进行滴定，测定壳聚糖衍生物样品中Cl-的含量，将滴定终点的AgNO3体积带入公式(1)计算蚕蛹壳聚糖季铵盐取代度。

(1)

其中：c为AgNO3标准溶液的浓度(moL/L)；v为AgNO3标准溶液的体积(mL)；w为蚕蛹壳聚糖季铵盐的重量(g)；DD为蚕蛹壳聚糖的脱乙酰度(%)；314为单元壳聚糖季铵盐的分子量；162为单元壳聚糖的分子量。

1.2.3 蚕蛹壳聚糖季铵盐的结构表征

采用BRUKER公司的VECTOR22型傅立叶变换红外光谱仪，用KBr压片法进行测定。将蚕蛹壳聚糖、蚕蛹壳聚糖季铵盐分别与KBr混合压片，以KBr为参比，然后用红外光谱仪分析，扫描次数15次，测定范围500～4000cm-1。

1.2.4 蚕蛹壳聚糖季铵盐的抑菌性能

采用涂布平板法制备试验平板，平板中涂布的菌液浓度分别为3×103、3×105和3×107CFU/mL。采用K-B纸片法进行抗菌性能检测，将滤纸用打孔器制成6mm的圆片，121℃高压灭菌后烘干，浸泡于1%、0.5%、0.25%的蚕蛹壳聚糖季铵盐溶液中12 h，置于试验平板中，于37℃培养48 h，测定抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 蚕蛹壳聚糖季铵盐的取代度

取代度反应蚕蛹壳聚糖氨基位被取代的百分数，用以衡量取代的难易程度。根据将滴定终点的AgNO3体积带入公式(1)，计算蚕蛹壳聚糖季铵盐取代度为33.61%。

2.2 蚕蛹壳聚糖季铵盐的结构表征

蚕蛹壳聚糖及其季铵盐的红外光谱分析见图1。

注：a为蚕蛹壳聚糖季铵盐；b为蚕蛹壳聚糖图1 蚕蛹壳聚糖及其季铵盐的红外光谱图

如图1所示，在蚕蛹壳聚糖的红外光谱在1653.87cm-1处存在N-H 的弯曲振动峰，而在蚕蛹壳聚糖季铵盐的红外图谱中1653.87cm-1处的N-H的弯曲振动峰已经消失；同时在1653.87cm-1和1479.66cm-1处出现了两个新的强吸收峰，这是季铵基团中-CH3的吸收峰；除此之外，二者的红外图谱波形相对来说没有明显差别。以上红外光谱数据表明蚕蛹壳聚糖分子中的-NH2上的氢原子已经成功地被EPTAC取代，制备得到了蚕蛹壳聚糖季铵盐。

2.3 蚕蛹壳聚糖季铵盐的抑菌性能

将蚕蛹壳聚糖季铵盐溶液进行抑菌圈试验，测试抑菌圈直径，效果如表1所示。

表1 蚕蛹壳聚糖季铵盐抑菌圈直径(cm)

注：-表示因平板中菌体生长过于分散，不能分辨抑菌效果，故未能测量抑菌圈直径。

由表1中结果可知，蚕蛹壳聚糖季铵盐对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，且随着试验平板中菌体浓度的增加，抑菌圈直径有下降的趋势。在菌体浓度均为3×107CFU/mL的情况下，蚕蛹壳聚糖季铵盐在金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径较大肠杆菌的大；在菌体浓度均为3×105CFU/mL的情况下，1%蚕蛹壳聚糖季铵盐在3×105CFU/mL浓度的大肠杆菌中的抑菌圈直径更大，而0.5%和0.25%蚕蛹壳聚糖季铵盐则在对金黄色葡萄球菌的抑菌中表现得效果更好。在金黄色葡萄球菌的抑菌试验中，由于3×103CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌在平板中生长得过于分散，无法分辨蚕蛹壳聚糖季铵盐各试验组的抑菌圈大小；在3×107CFU/mL和在3×105CFU/mL两个浓度的抑菌试验中，则仍表现出随菌体浓度增加，抑菌圈直径下降的结果。这是因为当抑菌剂含量一定时，抑菌圈的大小跟菌体浓度有很大关系，如果菌体浓度过大，会拮抗抑菌剂的作用，导致抑菌圈偏小。

3 结论

利用2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTAC)对自制蚕蛹壳聚糖进行季铵盐化改性，得到了取代度为33.61%的蚕蛹壳聚糖季铵盐。蚕蛹壳聚糖季铵盐对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较对大肠杆菌的强。