雌激素与孕激素联合应用对老龄小鼠乳腺的影响

宋 暮，高 慧，董巧香*

(温州医科大学 a检验医学院 生命科学学院，b公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035)

雌激素及孕激素是雌性动物体内重要的内分泌激素，围绝经期及绝经期女性因体内缺乏雌激素，将导致一系列生理及心理症状，如抑郁潮热、泌尿生殖系统萎缩、骨质疏松等。故而，临床常用补充外源性雌激素来改善上述症状。目前研究对于激素替代疗法增加乳腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌等的风险处于争议阶段[1]。相关乳腺癌的统计学资料表示，乳腺癌的发生发展与年龄密切相关，乳腺癌的发病人群主要为50岁以上的老龄女性，衰老能在某些程度上促进乳腺癌的发生和发展[2]。

激素替代疗法又名HRT，狭义的HRT即为雌激素替代疗法，目前常用的雌激素替代疗法包括单用雌激素、雌激素及孕激素序贯应用、雌激素及孕激素连续应用[3]等。因单用雌激素增加了子宫内膜癌的风险[4]，故此疗法仅用于无子宫的老年女性。雌、孕激素序贯疗法模拟正常生理周期，具有激素撤退性子宫出血等特点。而雌、孕激素连续应用因避免了子宫周期性出血而被广泛应用，临床调研表明，该法较其他疗法增加了乳腺癌的发病风险。研究表明，长期联合应用雌、孕激素增大了乳腺癌的发病风险，且服药时间越长，风险越高[5]。与此同时，也有研究表明，激素替代疗法对乳腺癌的发病风险被高估[5]。目前已有许多体内及体外模型研究激素替代疗法对雌性动物乳腺上皮组织及乳腺癌细胞系的影响。雌激素及孕激素能够促进人乳腺组织增殖，其表达相关标志物Ki67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)增加[6]。切除成年小鼠双侧卵巢构建绝经期动物模型，经雌激素疗法后，其乳腺上皮增殖能力及导管末端芽比例上升[7]。同时，激素替代疗法增加绝经期女性的乳腺上皮密度。应用孕激素增加了小鼠乳腺基底上皮群的比率且激活了RANKL及Wnt等相关通路。

衰老为生物体的增龄性功能下降，有基因组失稳，端粒耗损，干细胞衰竭等特征[8]。研究发现，衰老细胞积累及其释放某些细胞因子和各种蛋白酶，能够为敏感细胞群提供癌变环境。细胞损伤的增龄性累积是衰老的总原因[9]，同时，细胞损伤又为特定细胞发生癌变提供有利条件，并最终导致肿瘤的发生。

目前针对激素替代疗法与乳腺癌的研究主要着力于大范围的临床调研统计分析及应用去势的成年雌性小鼠模拟体内低激素水平研究激素替代疗法与乳腺组织学及相关通路，而摘除卵巢构建的绝经期小鼠模型不能完全模拟绝经期衰老及正常的内分泌环境，且切除卵巢会产生一定的创伤应激反应。本研究利用无动情周期的老龄小鼠，进行激素替代疗法，研究雌激素与孕激素联合应用对小鼠乳腺的影响，以期为激素替代疗法的临床用药及相关乳腺癌风险提供相应的依据及指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

C57-WT母本小鼠购自南京医科大学，本实验所用小鼠为母本小鼠在SPF级动物房自然繁殖的子代小鼠。

1.1.2 仪器与试剂

流式细胞仪，美国BD；石蜡切片机，德国Leica；光学显微镜及解剖显微镜，日本尼康。

雌二醇、孕酮粉剂、WM染液、苏木精及伊红染液，美国Sigma；免疫组化抗体ERα及Ki67，美国Stemcell。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理

取16月龄小鼠，随机分为3组，每组4只。对照组以芝麻油灌胃2个月，短期处理组以雌二醇联合孕酮灌胃14 d后改芝麻油灌胃至2个月，长期处理组以雌二醇联合孕酮灌胃2个月。根据临床用药指南[10]，雌孕激素联合应用基本疗法为雌二醇0.5～1 mg·d-1结合孕酮100 mg·d-1，根据人与动物药物换算公式及结合相关文献[11]，本实验所用雌二醇的剂量为150 μg·kg-1，孕酮剂量为15 mg·kg-1。雌二醇和孕酮粉剂按灌胃浓度置于芝麻油中并以超声助溶。

1.2.2 乳腺WM染色

取小鼠一侧腹股沟处乳腺，置于WM固定液中固定10 h，以70%、50%酒精及超纯水梯度处理后，置于WM染色液中过夜染色，染色后再以70%、95%及100%酒精梯度脱水，最后置于水杨酸甲酯中进行透化处理。导管分支点为随机选择一段二级导管，测量出长度(a)及计数出其上分支点的数目(n)，n/a的比值即为单位长度二级导管上的分支点数目。

1.2.3 乳腺HE染色

含有样本的切片经烘片，二甲苯、100%酒精、90%酒精、80%酒精、超纯水等处理后以苏木精染液染色40 s，分化后以伊红染色2 min，再经脱水处理后以中性树脂封片。HE染色后对乳腺导管进行分类统计，并对良性增生的导管比例进行统计分析。

1.2.4 乳腺IHC染色

含有样本的切片经烘片，二甲苯、100%酒精、90%酒精、80%酒精、超纯水一系列复水的过程后以柠檬酸钠或EDTA进行抗原修复，再经氧化氢处理，然后以0.3% PBST进行破膜，洗涤后以10%山羊血清进行封闭30 min。封闭后的切片去除血清，敷上合适浓度的一抗，4 ℃过夜后取出，合适浓度的含HRP的二抗孵育1 h后，去除二抗，洗涤后避光加入DAB染液避光孵育5 min，切片泛黄即可，再经超纯水、浓度梯度的酒精、二甲苯等进行脱水，最后以中性树脂进行封片。IHC染色结果为导管内阳性细胞与总导管细胞数目之比，记为染色阳性率。阳性细胞为染色为棕色的细胞。

1.2.5 统计分析

采用Graphpad Prism 6软件对数据进行单因素方差分析及t检验，测定结果以平均值±标准差表示，P<0.05时判定为差异显著。各组间差异显著性用*表示(P<0.05为*，P<0.01为**，P<0.001为***)。

2 结果与分析

2.1 对小鼠乳腺导管分支的影响

如图1所示，雌、孕激素长期联合处理后，小鼠乳腺导管密度增加，且乳腺导管三级分支增加，主要表现为单位长度乳腺二级导管上分支点的显著增多。雌孕激素短期处理后，其导管密度及单位长度乳腺二级导管上分支点无显著性改变。

2.2 对小鼠乳腺导管增生的影响

如图2所示，正常乳腺导管为外层基底上皮、内层管腔上皮细胞的双层结构。良性增生导管表现为导管内细胞增生呈多层结构，核染色质清晰，仍可见管腔。非典型增生表现为导管腔内大量不规则上皮细胞增生，细胞增生互相联结，弥漫成片，充塞管腔，形成实性，且核仁增大，形态不一，排列紊乱。结果表明，雌、孕激素长期联合处理后，乳腺导管良性增生比例增加，并出现非典型增生。雌孕激素联合短期处理后，乳腺导管组织学无显著改变。

2.3 对小鼠乳腺上皮细胞的影响

如图3所示，雌、孕激素长期联合应用后，小鼠乳腺上皮细胞中ERα阳性细胞核的比例上升，且增殖相关标志物Ki67的表达也上升。雌孕激素短期处理后，ERα及Ki67的表达无显著变化。

图1 WM染色结果

图2 HE染色结果

图3 IHC染色结果

3 讨论

雌激素、孕激素是乳腺导管发育及产生功能性作用的重要内分泌激素，目前对这两者的功能性作用及相互作用机制尚未阐明。雌孕激素替代疗法用于改善围绝经期及绝经期症状而在临床上广泛应用，对于其增加乳腺癌风险的相关性褒贬不一。目前部分研究表明，雌孕激素长期联合应用是乳腺癌发病风险增加的重要因素之一，但也有研究认为高估了激素替代疗法对乳腺癌发病风险增加的可能性。同时，一系列组织学检查及动物体内实验表明，雌、孕激素联合应用使人及小鼠乳腺组织呈高度增殖状态，而细胞过度分裂及增殖也可能在一定程度上增加如DNA损伤及基因编码异常的可能性[12-13]。

本实验对实验用老龄小鼠进行阴道分泌物涂片染色，其阴道图片所见细胞稀疏或无正常细胞，不符合正常阴道图片染色结果，且实验处理后解剖发现，其卵巢均表现为萎缩状或者形成囊肿，不具备正常卵巢分泌相关激素功能，因而，本实验用小鼠符合围绝经期或绝经期低雌激素及衰老的内环境。研究结果表明，经雌、孕激素长期处理后，乳腺导管的密度及分支点增加，表明乳腺处于动态性的增殖状态，且乳腺导管良性增生的比例增加，并出现非典型增生结构，而乳腺导管的非典型性增生是乳腺癌发病风险增加的重要表征之一[14-15]，表明雌二醇联合孕酮长期应用可增大乳腺癌的发病风险。Ki67作为细胞增殖的标志物被广泛应用，它作为细胞增殖相关的核抗原，在正常乳腺细胞和未病变的乳腺细胞中也有所表达，但是阳性率低于3%[16]。研究结果表明，对照组的Ki67阳性率低于3%，表明对照组小鼠乳腺组织具有正常的增殖状态。ERα为雌激素受体成员之一，是雌激素发挥作用的重要枢纽。已有研究表明，雌激素可作用于ERα，通过Stat5a及Gata 3等旁分泌机制作用于临近细胞，促进周边细胞群大量增殖及干细胞分化等[17]。免疫组化结果表明，雌、孕激素联合处理后ERα的比例上升，Ki67比例上升，结合WM染色和HE染色结果，我们推测这可能是在雌激素与孕激素的联合作用下，激活了ERα旁分泌系统，促进乳腺导管分支及类腺泡状导管芽形成，使乳腺组织呈增殖状态。

本研究采用了具备天然的无动情周期的老龄小鼠，对雌激素与孕激素联合应用对小鼠乳腺的影响做了一系列研究。本研究所用的实验对象很大程度上模拟了围绝经期及绝经期的低雌激素及衰老内环境的特征，填补了目前研究的不足。雌激素与孕激素联合应用短期对乳腺导管各项特征无显著影响，不增加乳腺癌的发病风险，而长期应用在一定程度上促进了乳腺的组织学改变及上皮细胞比例构成改变，同时促进乳腺组织的增殖。