孕期纳米银暴露对子代小鼠乳腺的影响

孙晓伟，高 慧，董巧香*

(温州医科大学 a检验医学院 生命科学学院，b公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035)

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸(0.1～100 nm)或由其作为基本单元构成的材料[1]，与普通材料相比，它在光学、热学、电学、磁学、力学以及化学等方面具有独特的性质[2]。纳米银(silver nanoparticles，AgNPs)是1种粒径小于100 nm的银单质，由于其具有良好的抗菌作用，现已成为应用最广泛的纳米产品之一[3-4]。已有研究发现，纳米银具有一定细胞毒性[5]、肝脏毒性[6]、生殖毒性[7]等生物毒性效应。Ivask等[8]在体外实验时发现，不同粒径的纳米银可以穿过哺乳动物细胞的细胞膜，对细胞产生损伤，粒径越小，毒性越强。体内实验表明，纳米银可以通过Balb/c小鼠的胎盘屏障或通过母乳而传递给子代，并引起胚胎的发育异常[9]。

乳腺干细胞(mammary stem cells，MaSCs)是一类成体干细胞，它对于雌性哺乳动物乳腺的发育十分重要[10]。乳腺上皮细胞分为基底细胞群和管腔细胞群[11]，乳腺干细胞可以分为基底干细胞和管腔干细胞，而乳腺干细胞的异常有可能会诱导形成乳腺癌干细胞，并进一步导致机体发生癌变。

本研究以FVB-GFP小鼠为实验动物，对孕期小鼠进行纳米银暴露，研究纳米银对子代小鼠乳腺导管和乳腺干细胞的影响，从而揭示纳米银诱导乳腺癌发生的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

成年FVB-GFP小鼠购自美国Jackson实验室，小鼠饲料和饮用水经过严格检测，均不含纳米银，可以排除外界因素对本实验的干扰。

1.1.2 实验仪器

石蜡切片机购自Leica公司；光学显微镜购自尼康公司；流式细胞仪购自BD公司；二氧化碳培养箱购自Thermo公司。

1.1.3 试剂耗材

纳米银、苏木精、伊红购自Sigma公司；Epicult-B基础培养基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult基础培养基和Mammocult Proliferation supplement购自Stem Cell公司；氯化铵溶液、0.25% Trypsin-EDTA、DNase I、Dispase和抗鼠CD24-PE抗体购自Stem Cell公司；抗人/鼠CD49f-PE/Cy7抗体购自Biolegend公司；胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理

将3月龄FVB-GFP雌性小鼠平均分成2组，根据雌雄比2∶1进行合笼，看到阴道栓的当天记作怀孕第0 d，怀孕第12～18 d进行灌胃处理。将纳米银颗粒放到超纯水中，超声，制成混悬液。处理组每日灌胃50 mg·kg-1纳米银混悬液，对照组灌胃同样记录的超纯水[12]。

1.2.2 小鼠脏器及乳腺组织的采集与处理

小鼠麻醉后，颈椎脱臼处死。将小鼠腹部向上固定，用外用手术刀剪开外皮，取下左侧胸腺处乳腺，放到福尔马林中，用于石蜡包埋以及病理切片的制备。左侧腹股沟处乳腺在玻片上摊平后放到固定液中用于整体染色，右侧乳腺消化后制成单细胞悬液。用内用手术刀剪开腹腔膜，取出子宫和肝脏，称重后，放到福尔马林溶液中固定。

1.2.3 细胞流式分选

将组织放到消化液中，恒温培养消化，依次加入氯化铵、胰蛋白酶、中性蛋白酶和DnaseⅠ，得到单细胞悬液。分别加入不同荧光素标记的CD24-PE、Streptavidin-APC、CD49f-PE/Cy7抗体，分选得到不同的细胞群：Lin-CD24+CD49fhi基底干细胞和Lin-CD24hiCD49flo管腔干细胞。

1.2.4 微球和3D培养

将分选得到的不同细胞群按照一定比例种在不含血清的培养基中，5 d后形成微球，计数并计算微球形成率。在显微镜下挑取约50个微球重悬于基底膜基质中，加入含有血清的培养基，9 d后，观察并记录3D结构的形态和大小。

1.2.5 乳腺增生导管的定量分析

将浸泡在福尔马林中的乳腺组织用石蜡包埋后，4 μm切片，然后经过伊红-苏木素染色，可以清晰看到乳腺导管的结构。正常的乳腺导管由2层细胞构成，而增生导管细胞层数发生明显紊乱。在显微镜下统计正常和增生导管的数目，计算增生导管的比例。

1.3 数据统计分析

采用Graphpad Prism 6软件对数据进行单因素方差分析及T检验, 测定结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 对子代小鼠肝脏和子宫的影响

孕期纳米银暴露对子代小鼠肝脏和子宫的影响见图1。肝脏指数可以在一定程度上反应药物的毒性强弱。研究发现，处理组小鼠肝脏指数显著降低，表明纳米银对小鼠产生了显著的肝脏毒性效应。子宫是雌性哺乳动物重要的生殖器官，它对于乳腺的发育具有非常关键的调节作用。取出小鼠子宫，测量其长度和直径，小鼠子宫的长度和直径并无显著差异，表明孕期纳米银暴露对子代小鼠的子宫并没有产生毒性效应。

图1 小鼠肝脏指数和子宫形态变化

2.2 对子代小鼠乳腺形态的影响

为了观察纳米银对乳腺形态的影响，用胭脂红染液对乳腺组织进行整体染色并观察(图2)。正常的乳腺导管具有清晰的二级和三级分支结构，处理后三级结构明显减少。同时，乳腺组织中的淋巴结可以表征炎症反应，由图可以看出处理后淋巴结面积明显增大，表明孕期纳米银暴露可以引起子代小鼠的炎症反应。

图2 小鼠乳腺导管形态

2.3 对子代小鼠乳腺病理学结构的影响

乳腺组织包埋后4 μm切片，经过伊红-苏木素染色后，可以清晰看到乳腺导管的细胞组成(图3)。正常导管由规则的2层细胞组成，增生后，细胞层数增多。处理后增生导管的比例并没有发生明显的变化。

上述结果表明孕期纳米银暴露子代乳腺导管并没有产生明显的病变。

图3 小鼠乳腺病理学结构

2.4 对子代小鼠乳腺干细胞组成的影响

根据不同的细胞表面标记，乳腺干细胞可以分为2个不同的细胞群：基底干细胞群(Lin-CD24+CD49fhi，MRU)和管腔干细胞群(Lin-CD24hiCD49flo，CFC)。处理后，基底干细胞和管腔干细胞占总乳腺上皮细胞的比例并没有发生明显变化，表明孕期纳米银暴露并不会改变子代小鼠乳腺干细胞的组成(图4)。

图4 小鼠乳腺干细胞组成变化

2.5 对子代小鼠微球和3D形态的影响

将分选得到的细胞群进行无血清培养后可以得到乳腺微球结构，统计每1 000个细胞形成的微球个数(图5)。研究发现，处理后管腔干细胞的微球形成率显著降低，但是基底干细胞的微球形成率没有发生变化。将管腔干细胞形成的微球重悬于基底膜基质中，可以形成3D结构。测量3D结构的直径，并统计空心结构的比例，发现处理组3D结构的直径明显降低，而且空心结构的比例也显著减少。孕期纳米银暴露可以降低管腔干细胞的微球形成率，并且影响其3D结构的直径和形态。

3 讨论

纳米银因其具有广泛的杀菌作用而应用到日常生活的方方面面。研究发现，纳米银可以通过口服、皮肤接触、静脉注射等多种方式进入生物体内，并随着血液循环运输到身体的其他部位[13]。通过啮齿类动物的体内和体外实验发现，纳米银可以产生各种生物毒性效应，并传递给子代[14]。

本研究以FVB-GFP转基因小鼠为实验动物，在怀孕第12～18 d进行连续一周的纳米银暴露。处理后子代小鼠的肝脏指数发生了显著的变化，说明纳米银可以产生一定的毒性，但是这种毒性效应并没有影响子宫的形态发育。

有研究发现，乳腺导管的分支结构、密度以及病理学结构的异常等都有可能成为乳腺组织发生病变的参考因素[15]。本实验中，处理后的乳腺导管二级和三级结构发生了明显的异常变化，这说明，孕期纳米银暴露可能是子代乳腺病变甚至发生癌变的一个危险因素。同时，淋巴结面积的增大说明机体产生了炎症反应，表明纳米银可能通过炎症反应使乳腺形态发生异常。

在乳腺干细胞的微球和3D形成实验中，发现纳米银可以影响管腔干细胞的微球形成率，但是对基底干细胞几乎没有影响。通过进一步的3D重悬培养，发现纳米银可以显著减小3D结构的直径，而且其形态也发生了明显的变化。

图5 小鼠乳腺微球和3D结构形态

孕期是纳米银暴露的一个敏感窗口。纳米银可以产生肝脏毒性，影响乳腺导管的形态，对乳腺干细胞尤其是管腔干细胞的发育与分化具有显著的影响，这些发现为乳腺病变或乳腺癌的预防与治疗提供了一定的理论参考价值，其机制还有待于我们的进一步探索。