联合检测结直肠癌中GLUT-1、HIF-1α表达的临床意义

武雪亮，王立坤，周海丰，郭 飞，杨永江，刘 博，杨东东*，屈 明，薛 军

(河北北方学院附属第一医院 1.普通外科； 2.超声医学科； 3.病理科， 河北 张家口 075000)

据2012年全球肿瘤流行病数据统计：中国人群的结直肠癌目前排位死因顺位从第7位上升到第5位，男女死亡率分别为9.0/10万和6.1/10万，严重威胁国民健康[1]。尽管近年来结直肠癌的普查力度不断加强，手术方式不断改进，靶向药物大力推广，并取得了一系列的成就和提高，但结直肠癌的5年生存率不足60%，仍是公共卫生的关键问题，每年造成约608 000例患者死亡[2]。因此，对结肠直肠癌的深入研究尤对其分子生物学研究具有很高的临床价值。

葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)是葡萄糖转运蛋白家族中最重要的成员，广泛存在于真核生物和原核生物中，在癌症发展阶段，包括早期肿瘤生长，癌症转移和侵袭等方面均具有重要作用。相关报道证实，在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌等肿瘤细胞内均发现GLUT-l的高表达，GLUT-l的活性和表达水平与肿瘤的恶性生物学行为密切相关[3-5]，而GLUT-1在结直肠癌方面的研究鲜有报道。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞在低氧条件下产生的一种核转录因子，在恶性肿瘤的发生发展过程中，扮演着重要的角色，能增强其侵袭性，是近年研究较多的致癌因子。本研究通过对结直肠癌和癌旁正常结直肠组织中GLUT-1和HIF-1α行免疫组织化学染色分析半定量检测，旨在探讨GLUT-1和HIF-1α在结直肠癌中的表达情况及与相关临床病理因素间的关系，为结直肠癌的靶向诊疗提供科学参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

收集河北北方学院附属第一医院普通外科2016年9月至2017年1月手术切除的结直肠癌组织50例和同期同例癌旁正常结直肠组织50例，结直肠的癌组织自癌灶中心处取得，另外取经病理证实为正常肠组织的标本切缘。本研究经本院伦理委员会批准，患者知情同意参加本研究。所有病例均为原发性肿瘤，术前没有行针对性治疗，如新辅助放化疗等，术后标本均在1 h内获得，并存于液氮中。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗GLUT-l多克隆抗体、鼠抗HIF-1α单克隆抗体购于美国Abcam公司；免疫组化试剂盒、DAB显色剂购于上海Gene Tech公司。光学显微镜：Nikon Eclipse 50；台式高速离心机：德国Eppendorf公司；冰冻切片机：北京格美胜达医疗设备有限公司；低温冰柜：青岛海尔公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学染色及半定量测定[6]

10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚度4 μm，应用苏木精-伊红染色，行病理诊断。用80℃烤箱对切片进行烘烤30 min，再用乙醇进行脱水，并使内源性过氧化物酶灭活，应用枸橼酸缓冲液行高温高压水化修复过程；之后PBS洗3次，加入一抗(1∶100)50 μL，温度控制于4℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μL。室温下DAB显色，PBS洗3次，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化后流动清水冲洗10 min，梯度乙醇脱水，松节油透明和树胶行封片处理，PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行半定量测定，计算单位面积阳性染色积分光密度值，取均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 结直肠癌、癌旁正常组织中GLUT-1和HIF-1α表达情况

癌组和癌旁正常组织中GLUT-1表达量分别为(2.285±0.459)和(1.086±0.148)，组间差异有显著性(t=8.919，P< 0.001)；癌组和癌旁正常组织中HIF-1α表达量分别为(2.203±0.401)和(1.055±0.127)，差异有显著性(t=7.144，P< 0.001)，见图1、2。

2.2 GLUT-1和HIF-1α表达与结直肠癌临床病理特征的关系

GLUT-1和HIF-1α的表达量都和肿瘤的浸润深度、分化程度、TNM分期、淋巴转移、肝转移和脉管浸润有关(P< 0.05)。TNM分期高、分化程度低、伴淋巴结转移、肝转移和脉管浸润的患者GLUT-1和HIF-1α的表达量均升高，而GLUT-1和HIF-1α的表达量与患者肿瘤大小无相关性(P> 0.05)，见表1。

注：A1：癌旁正常组织中GLUT-1表达(×200)；A2：结直肠癌组织中GLUT-1表达(×200)；B1：癌旁正常组织中HIF-1α表达(×200)；B2：结直肠癌组织中HIF-1α表达(×400)。图1 癌旁正常结直肠组织和癌组织中GLUT-1和HIF-1α蛋白的表达(SP法)Note. A1: GLUT-1 expression in normal adjacent tissues(×200); A2: GLUT-1 expression in colorectal carcinoma tissues(×200); B1: HIF-1α expression in normal adjacent tissues(×200); B2: HIF-1α expression in colorectal carcinoma tissues(×400).Figure 1 Expression of GLUT-1 and HIF-1α in human colorectal carcinoma tissues and normal adjacent tissues. Streptavidin-peroxidase (SP) method

注：与癌旁正常组织比较，*P< 0.001。图2 免疫组化半定量表达检测分析Note. Compared with the normal adjacent tissues,*P< 0.001.Figure 2 Quantitative immunohistochemical detection and analysis

病理参数Pathological parametersnGLUT-1表达量GLUT-1 expression levelHIF-1α表达量HIF-1α expression level肿瘤大小(cm) Tumor size≥ 5322.289±0.4032.177±0.395< 5182.080±0.4242.039±0.271分化程度 Differentiation degree高 High122.061±0.1071.950±0.101中 Moderate212.330±0.1722.199±0.117低 Low172.510±0.1032.407±0.095浆膜浸润 Serosal invasion有 Yes392.452±0.3702.343±0.261无 No112.074±0.2512.015±0.239TNM分期 TNM stageⅠ + Ⅱ81.830±0.4021.801±0.399Ⅲ + Ⅳ422.366±0.4572.254±0.346淋巴结转移 Lymph node metastasis有 Yes332.431±0.3862.320±0.297无 No172.080±0.2721.971±0.254肝转移 Liver metastasis有 Yes72.477±0.4602.366±0.451无 No431.845±0.4111.831±0.402脉管浸润 Vascular infiltration有 Yes162.358±0.4112.247±0.405无 No341.996±0.2851.961±0.274

注：除肿瘤大小外，其他各病理参数不同程度间比较，P< 0.05。

Note. Comparison among different degrees for each pathological parameter except for tumor size,P< 0.05.

2.3 GLUT-1和HIF-1α在结直肠癌中表达的相互关系

相关性分析散点图表明，GLUT-1和HIF-1α在结直肠癌中的表达呈正相关(r=0.958，P< 0.001)，见图3。

图3 GLUT-1和HIF-1α相关性分析散点图Figure 3 Scatter plot of correlation analysis of GLUT-1 and HIF-1α

3 讨论

结直肠癌的发生、发展是多个基因调控的多步骤、多因素、多阶段的复杂过程，其中失控性生长和不断侵袭增殖是恶性肿瘤细胞的最主要特征，这种特征的维系主要靠葡萄糖的无氧酵解为其提供能量，该过程即使在氧充足的环境下仍可持续进行[7]。由于肿瘤的高消耗、高代谢，需要较普通细胞成倍的能量。而正常情况下，葡萄糖无法独立通过细胞膜的双分子层结构，必须依赖跨膜分布的葡萄糖转运蛋白作为载体，因而这类载体的活性及表达量对肿瘤细胞的恶性增殖具有极其重要的意义[8]。

GLUT-1是葡萄糖转运蛋白家族最重要的成员，GLUT-l内含492个氨基酸，由12个疏水性的跨膜α螺旋结构域、两个电荷的膜内区及膜外区构成[9]。Deng等[10]解析的人源GLUT-l的晶体结构显示其经典的协助转运超家族的折叠方式：12个跨膜螺旋组成NH2-端和-COOH端2个结构域，其中的腔孔呈向胞内区展开，这即是其转运的基础框架。

肿瘤细胞膜上的GLUT-l的表达受多种途径调节，目前研究较多的有PI3K/AKT/mTOR(磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白)途径、HIF-1α(缺氧诱导因子-1α)和p53途径，PI3K/AKT/mTOR与癌细胞的增殖、微血管形成和转移蛋白的合成关系密切，且需要大量能量供应，在肝癌、胃癌、子宫癌等肿瘤细胞中均证实能上调GLUT-l的表达[11]。

本研究显示GLUT-l和HIF-1α在结直肠癌中的表达量明显高于在癌旁正常组织，表明在肠黏膜癌变的过程中，细胞膜上的GLUT-l和HIF-1α表达水平不断上调，从而确保肿瘤对能量的摄取。进一步研究显示，GLUT-l和HIF-1α表达量与结直肠癌的病理分期、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、肝转移和脉管浸润均明显相关，且散点图分析显示二者呈明显正相关。HIF-1α是调控癌细胞对缺氧耐受的关键蛋白，研究表明：在肝癌细胞内，HIF-1α能直接激活GLUT-l等糖酵解相关因子活性，从而满足肝癌细胞的能量摄取，增强其对缺氧的耐受力[12]；在胃肿瘤体外培养的细胞内，缺氧条件下应用HIF-1α抑制剂处理后，癌细胞内活性氧比例更高，凋亡更显著[13]。国内杨通印等[14]对142结直肠癌组织性免疫组化检测发现GLUT-l和HIF-1α表达明显高于正常肠黏膜，且二者存在协同作用，在低氧环境下，HIF-1α表达上调能诱导GLUT-l高表达，加速癌细胞糖酵解，促进癌细胞浸润和转移。

综上，GLUT-l异常表达对结直肠癌的发生和进展有重要作用，深入探究GLUT-l和HIF-1α的作用机制有望为结直肠癌精确治疗提供重要的理论依据。