SIVmac239病毒感染CEMx174细胞过程分析

李 想，童 玲，丛 喆，薛 婧

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫计委人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，北京 100021)

获得性免疫缺陷综合征是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的人类免疫系统缺陷疾病。HIV感染细胞主要包括三个步骤：黏附、融合和进入[1]。早期研究发现，HIV的主要细胞受体为CD4分子，HIV首先附着在细胞表面的CD4分子上，然后融合进入细胞[2-3]。猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)是从灵长类动物身上分离得到的类似于HIV的病毒，SIV恒河猴模型被认为是研究艾滋病最有效的模型，而SIVmac239是常用的SIV病毒[4]。因此，为观察病毒吸附和感染细胞的全过程，本研究使用SIVmac239病毒感染CEMx174细胞，通过运用不同的技术方法，观察病毒与CEMx174细胞的吸附，以及病毒感染细胞的整个过程。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 病毒株

感染毒株为SIVmac239，由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston Marx博士惠赠。使用CEMx174细胞扩增制备，TCID50为3 × 105/mL。

1.1.2 细胞

CEMx174细胞，由本实验室保藏。悬浮生长，生长速度较快，按照1∶5传代培养，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，置于37℃、5% CO2孵箱中培养。

1.2 主要试剂与仪器

Anti-monkey IgG-FITC antibody(货号：F3839-1ML)购自美国Sigma公司，goat anti-mouse IgG FITC conjugate(货号：010300002)购自爱博生公司，小鼠抗SIV p27 Western blot单克隆抗体(克隆号：3G3)由本实验室制备[5]，小鼠抗SIV p27流式抗体(克隆号：4D5)由爱博生生物技术有限公司制备，IC fixation buffer(货号：00-8222-49)和10×permeabilization buffer(货号：00-8333-56)购自eBioscience公司。BD AccuriTMC6流式细胞仪，Leica激光共聚焦扫描显微镜，ABI 7500实时荧光定量PCR仪，Bio-Rad电泳仪，Tanon化学发光分析系统，Nikon倒置显微镜，日本Hitachi CF16RXⅡ高速离心机，Dynamica台式离心机，ESCO生物安全柜，Thermo Forma二氧化碳恒温培养箱。

1.3 实验方法

1.3.1 病毒吸附及感染

取2 mL浓度为每毫升1 × 106个的CEMx174细胞加入六孔板中，每孔加入40 μL SIVmac239病毒，将细胞与病毒悬液混匀后置于4℃吸附30 min，吸附结束后，10 mL完全培养液漂洗3次，4℃、2000 r/min离心3 min，弃上清，添加新的培养液37℃、5% CO2孵箱中继续培养。

1.3.2 样本的收集与处理

CEMx174吸附病毒后，分别在0.5，12，24，48，72，96 h时，取细胞培养上清，提取病毒RNA，real-time PCR检测病毒载量的变化；离心后的细胞，一部分用于制备细胞涂片，IFA检测并用激光扫描共聚焦显微镜观察病毒定位及复制情况；一部分用于胞内流式，检测细胞内病毒蛋白p27含量的变化；其余细胞进行裂解，提取蛋白，利用Western blot检测细胞内病毒蛋白p27表达量的变化。

1.3.3 培养上清中病毒载量的检测[6-7]

收取不同感染时间的培养上清，运用TRIzol法提取培养上清中的病毒RNA，根据SIVgag基因的保守序列设计引物，利用real-time PCR测定培养上清中的病毒RNA，实验步骤详见参考文献[6-7]。

1.3.4 IFA检测SIVmac239病毒抗原[8]

将收取的细胞用PBS洗两次后，调整至合适的细胞浓度，涂于玻片孔中干燥后冰丙酮固定30 min。SIV感染猴血浆灭活后用PBS(1∶20)稀释，滴加至玻片孔中，将滴加完成的玻片放入湿盒内，37℃孵育30 min。孵育结束后，取出玻片，PBS漂洗3次，每次浸泡5 min，其间轻轻震摇数次。用纸巾拍干，加入PBS稀释的anti-monkey IgG-FITC antibody(1∶400)，滴加完成后放入湿盒，37℃孵育30 min。孵育结束后，PBS漂洗3次，每次浸泡5 min，其间轻轻震摇数次。纸巾拍干，DAPI封片后，即可在激光扫描共聚焦显微镜下观察结果。

1.3.5 胞内流式检测SIVmac239病毒p27蛋白[9]

收取细胞，每管1 × 106个细胞，加入100 μL IC fixation buffer于4℃固定20 min，加入2 mL 1× permeabilization buffer于4℃、2000 r/min离心3 min，洗2次后100 μL重悬细胞，加入1 μg SIV p27流式抗体，4℃孵育30 min。孵育结束洗2次后，100 μL重悬细胞，加入2 μg goat anti-mouse IgG FITC conjugate，4℃孵育30 min。孵育结束后，分别用2 mL 1× permeabilization buffer洗2次和2 mL PBS洗1次，适量PBS重悬细胞后流式仪检测p27表达量。

1.3.6 Western blot检测CEMx174细胞中p27蛋白表达[5]

病毒感染细胞后不同时间点收取细胞，用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白的浓度。取30 μg总蛋白100℃变性后，12% SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至NC膜上，含5%脱脂奶粉的TBST封闭，小鼠抗SIV p27单克隆抗体用封闭液1∶2000稀释后，4℃孵育过夜。二抗为辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体，内参用辣根过氧化物酶偶联的β-actin抗体，均用TBST 1∶15 000稀释，室温孵育1 h，加入酶作用底物显影后，凝胶成像分析系统扫描分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 SIVmac239感染CEMx174过程中的细胞病变

SIVmac239感染CEMx174细胞后48 h即可出现个别明显的细胞病变——多细胞融合形成巨大的融合泡(图1B)；到感染后96 h时，细胞病变严重，出现大量的晚期细胞融合泡，泡内细胞结构消失甚至融合泡破裂，内容物溢出(图1C)。

注：A：正常CEMx174细胞(× 20)；B：SIVmac239感染48 h时的CEMx174细胞(× 20)；C：SIVmac239感染96 h时的CEMx174细胞(× 20)。箭头指示细胞病变。图1 SIVmac239病毒感染CEMx174细胞后的细胞病变Note. A: Uninfected CEMx174 cells (× 20); B: CPE of CEMx174 cells at 48 hours post-infection by SIVmac239 (× 20); C: CPE of CEMx174 cells at 96 hours post-infection of SIVmac239 (× 20). Arrows indicate the cytopathic effect.Figure 1 Cytopathic effect (CPE) in CEMx174 cells infected by SIVmac239

2.2 SIVmac239感染CEMx174细胞过程中培养上清病毒载量的变化

SIVmac239病毒在4℃吸附细胞CEMx174 0.5 h后，检测上清中病毒载量，结果显示，上清中的病毒RNA水平为每毫升1 × 104.5拷贝，病毒感染细胞12 h时培养上清中病毒载量下降，为每毫升1 × 104拷贝，此后至病毒感染细胞96 h，培养上清中的病毒RNA水平持续升高至每毫升1 × 109拷贝。如图2所示。

图2 SIVmac239感染CEMx174细胞过程中培养上清病毒载量的变化Figure 2 Viral RNA level in culture supernatants of SIVmac239-infected CEMx174 cells

2.3 使用激光扫描共聚焦显微镜检测SIVmac239感染CEMx174细胞的过程

SIVmac239病毒4℃吸附细胞CEMx174 0.5 h后，细胞膜上检测到绿色点状荧光，绿色点状荧光所在的位置即为病毒所在的位置(图3B)。病毒感染细胞12，24，48 h时，在细胞膜上均观察到绿色点状荧光。感染至第72 h和第96 h时，细胞胞浆内检测到大量的绿色点状荧光(图3C、3D)，呈现新月状、戒指状或圆环状。

2.4 SIVmac239感染CEMx174过程中胞内p27蛋白表达量的变化

SIVmac239感染CEMx174细胞后，胞内流式和蛋白质免疫印迹检测细胞内病毒蛋白p27的表达。胞内流式结果显示感染至第24 h时，可以检测到病毒蛋白p27，但与感染第12 h相比，无明显变化。感染至第48 h时，表达病毒蛋白p27的细胞所占百分比为(1.05±0.10)%，比例明显增加(P< 0.01)；

注：A：正常CEMx174细胞(× 63)；B ～ D：SIVmac239病毒感染细胞0.5，72，96 h时抗原检测(× 63)。箭头所指的点状绿色荧光，即为病毒所在的位置。图3 IFA检测感染SIVmac239病毒的CEMx174细胞内的病毒抗原Note. A: Uninfected CEMx174 cells (× 63); B-D: Detection of the antigen on cells at 0.5, 72, and 96 h post-infection by SIVmac239 (× 63). The green fluorescence dot pointed by the arrow indicates the location of the virus.Figure 3 IFA showing the virus antigen in SIVmac239-infected CEMx174 cells

注：A、B：胞内流式检测不同时间细胞内p27的变化；C：蛋白质免疫印迹检测病毒感染细胞0.5，12，24，48，72 h及96 h p27蛋白表达量的变化。感染48 h时与正常对照组相比，** P< 0.01。图4 SIVmac239感染的CEMx174细胞内p27蛋白表达量的变化Note. A, B: Intracellular cytokine staining (ICS) shows the expression of SIV p27 in different times. C: The expression of SIV p27 in CEMx174 cells 0.5, 12, 24, 48, 72 and 96 hours post infection of SIVmac239. Compared with normal control group when infected with 48 h,** P < 0.01.Figure 4 Change in the expression of SIV p27 in SIVmac239-infected CEMx174 cells

此后至感染第96 h，表达SIV p27的细胞所占的比例逐渐升高，至第96 h时所占的比例为(19.75±0.64)%(图4A、4B)。

蛋白质免疫印迹阴性对照为未感染病毒的正常CEMx174细胞，在1 ～ 7泳道内参蛋白条带灰度大致相同的情况下，检测细胞胞浆中的p27蛋白。病毒吸附感染细胞0.5 ～ 24 h细胞胞浆中未能检测到病毒蛋白p27，在病毒感染CEMx174细胞48 h时开始检测到病毒蛋白p27，并且在之后的48 h，细胞胞浆中的SIV p27表达量呈逐渐递增的趋势(图4C)。

3 讨论

早期研究发现，HIV在感染细胞时首先黏附在细胞上，然后再进入细胞[10]。为观察病毒吸附细胞及病毒感染细胞的全过程，本研究用SIVmac239病毒感染CEMx174细胞，运用不同的技术方法，观察病毒与细胞吸附以及病毒感染细胞的全过程。

本研究中，SIVmac239病毒4℃吸附细胞0.5 h后，间接免疫荧光法检测病毒的定位，结果显示，细胞膜上检测到病毒颗粒，表明病毒在感染细胞时，首先吸附在细胞膜上，但是检测到的吸附在细胞膜上的病毒颗粒较少，说明虽然在吸附感染时加入的病毒量很大，但是能有效吸附细胞的病毒较少。在对培养上清中的病毒RNA进行检测时发现，SIVmac239病毒吸附感染细胞第0.5 h至第96 h，培养上清中均能检测到病毒RNA，病毒感染细胞12 h后，培养上清中的病毒载量下降，但是与加入的病毒相比下降不明显，从而可知，病毒在感染细胞时，能真正感染细胞的病毒较少，推测一定量的细胞在被病毒感染时，能感染细胞的病毒具有最大量，当病毒的量超出最大限度时，超出部分的病毒将无法感染细胞。在检测病毒的核心蛋白p27时，病毒感染细胞第24 h时，胞内流式即可检测到病毒蛋白p27，而Western blot在病毒感染细胞48 h时开始检测到病毒蛋白p27，此后至病毒感染细胞96 h，SIV核心蛋白p27表达量逐渐升高，与培养上清中的病毒RNA、间接免疫荧光检测病毒复制情况的变化趋于一致。

综上所述，SIVmac239感染细胞CEMx174时，病毒首先吸附在细胞膜上，然后进入细胞，从感染后第12 h随着感染时间的增加，培养上清中病毒RNA水平持续升高，病毒持续复制，细胞内病毒核心蛋白p27的表达量逐渐增加。另外，检测水平和实验方法不同，使实验结果出现不同程度的差别，可根据实验的目的和需要，选择合适的检测水平和实验方法。