藁本内酯上调miR-181b减轻氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞炎症损伤

黄志勇，田广永，曹 玲，詹坚宏，赵丹丹，于云红，周凤华*

(1.南方医科大学第三附属医院耳鼻咽喉头颈外科，广州 510630； 2.南方医科大学中医药学院，广州 510515； 3.广东省人民医院中医科，广州 510080)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种与内皮损伤、炎症因子介导、脂质沉积浸润有关的慢性炎症反应[1-2]。虽然AS的发病机制复杂，但内皮细胞损伤是其公认的始动环节。氧化低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein，ox-LDL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)等均可损伤或激活内皮细胞，导致细胞的通透性增加，表面黏附分子如细胞黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和E-选择素等表达增加，单核细胞通过内皮黏附分子黏附于损伤内皮表面，迁移为巨噬细胞，从而过度摄取脂质形成泡沫细胞，大量泡沫细胞堆积于血管内壁，最终导致AS的发生[3-5]。

藁本内酯(ligustilide，LIG)，又名东当归酞内酯，是川芎和当归中主要的内酯类化合物，也是其主要的活性成分。LIG在神经保护、抗肿瘤、心脑血管、循环系统及免疫功能等方面均有较强的药理作用。有研究表明LIG具有一定的抗AS作用[6]，但其作用机制并不明确。本课题采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)损伤模型，通过研究LIG对HUVEC内炎性细胞因子表达调控作用，探讨LIG保护内皮细胞及抗AS的药理机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

第二代人源HUVEC细胞(批号ZQ00446，上海中乔新舟科技公司)。

1.2 主要试剂与仪器

药物：藁本内酯(纯度> 98%，批号111737-201608，广州市药检所，化学结构见图1)用适量二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再用PBS稀释；ox-LDL(批号YB-002，广州奕源生物公司)。

图1 藁本内酯化学结构Figure 1 Structure of ligustilide

其他试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清(批号03/17、F7676，美国Gibco公司)；CCK8试剂盒(批号CK04，上海东仁科技公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(批号40302ES20，南京凯基生物公司)；TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1 ELISA试剂盒(批号CSB-E04740h、CSB-E04638h、CSB-E04574h、CSB-E04753h，武汉华美生物公司)；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(批号9109、RR037A、RR420A，Takara公司)；兔抗NF-κB p65抗体、兔抗GAPDH、小鼠抗兔二抗(批号8242、5174S、14708s，美国CST公司)；miR-181b mimics、miR-181b inhibitor(批号5632、5634，上海吉玛制药公司)。引物均由广州天骏公司合成。

仪器：超净台(香港力康生物医疗集团)；细胞培养箱、MK3型酶标定量测定仪、反转录仪及荧光定量PCR系统(美国Thermo公司)；Echo-Plus型全自动生化仪(意大利爱康公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；TSl00-F型Eclipse Ti荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；Image Station 2000MM多功能成像系统(美国Kodak公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组

取对数生长期细胞进行实验，将细胞随机分为5组：对照组、模型组(100 μmol/L ox-LDL干预24 h)、LIG低浓度组、LIG中浓度组、LIG高浓度组。其中，LIG低、中、高浓度组细胞分别以10、20、40 μmol/L预先孵育2 h，再用100 μmol/L ox-LDL干预24 h。分别检测细胞增殖及凋亡情况。

1.3.2 细胞增殖实验

将第3代对数增长期细胞按1 × 105/mL密度接种于96孔板上，每组6个孔，常规培养24 h后更换培养基，分为空白组、阴性对照组、模型组、LIG低中高浓度组，其中LIG每组分别加入10、20、40 μmol/L LIG预先孵育2 h，每孔再加入5 g/L的CCK-8液10 μL，置于培养箱孵育1 ～ 2 h，然后于酶标仪460 nm处检测OD值。计算公式如下：存活率(%)=(As - Ab)/(Ac - Ab) × 100%，其中，As、Ab和Ac分别是实验组(含有细胞的培养基和药物)、空白组(不含细胞的培养基)和阴性对照组的吸光度(含有细胞的培养基)。

1.3.3 细胞凋亡检测

细胞分组干预后离心收集，加入100 μL binding buffer混匀，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光反应10 min，再加入400 μL binding buffer混匀，立即上流式细胞仪检测(激发波长488 nm，发射波长530 nm)，计算细胞凋亡指数。

1.3.4 炎性细胞因子检测

采用ELISA法，将细胞接种于10 cm细胞皿，细胞分组处理同前。培养终止后，吸出培养液，用PBS充分洗涤后将其转移到离心管，用PBS稀释到10 × 106/mL，-20℃过夜(两轮反复冻融破坏细胞)，4℃、5 × 104r/min离心5 min，取上清液按说明书进行操作，分别计算细胞中TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1的浓度。

1.3.5 实时荧光定量PCR

提取细胞总RNA，合成cDNA：总反应体系20 μL，组成为14 μL模板RNA，2 μL enzyme mix，5 × RT缓冲液4 μL，42℃反应60 min，95℃反应5 min，将合成好的cDNA保存于-20℃。荧光定量PCR：总反应体系20 μL由2 × PCR反应混合物10 μL、cDNA 1 μL、目的基因引物0.5 μL、20 × SYBR 1 μL与H2O 7.5 μL组成。95℃反应10 min，再转向95℃ 10 s，60℃ 1 min共40个循环。目的基因与内参GAPDH的引物序列见表1，相对表达量用2-△△Ct表示，实验重复3次。

表1 目的基因与内参的引物序列Table 1 Primer sequences for target genes and the internal control gene

1.3.6 免疫印迹实验

提取细胞总蛋白，采用BCA法进行定量，按照每孔上样50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，积层胶和分离胶浓度分别为5%和12%，采用半干转膜法转膜70 min，将蛋白从胶上转移到PVDF膜上，再用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜(1∶2000)，二抗37℃孵育1 h(1∶5000)，ECL法显色成像，图像采用Image Tool 3.0分析光密度值(IOD)，实验设立GAPDH为内参照，重复3次以上。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 藁本内酯对HUVEC细胞增殖及凋亡的影响

与对照组相比，ox-LDL能显著诱导HUVEC细胞损伤，抑制细胞存活率，促进其凋亡。中、高浓度LIG预处理2 h能减轻HUVEC损伤，与模型组相比差异有显著性(P< 0.01，表2)，说明LIG具有减轻ox-LDL诱导的HUVEC细胞损伤作用。

2.2 藁本内酯对HUVEC内炎性细胞因子含量的影响

与对照组相比，ox-LDL能显著增加细胞内TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1等促炎细胞因子及细胞黏附分子分泌，进一步诱导细胞损伤。LIG各浓度组可明显抑制这些细胞因子的分泌，与模型组相比差异有显著性(P< 0.01，表3)，提示LIG可能主要通过抑制炎性因子分泌，减轻细胞炎症反应，从而减轻ox-LDL诱导的细胞损伤。LIG具有一定的抗炎作用，这也与文献报道一致[7]。

2.3 藁本内酯对HUVEC内炎性因子及miR-181b mRNA水平的影响

为进一步探讨LIG对TNF-α、IL-6等炎性因子的表达调控，本研究检测了这些细胞因子的转录水平。中、高浓度LIG预处理组能显著降低TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1的转录水平，与模型组相比差异有显著性(P< 0.01，表4)，说明LIG能降低TNF-α、IL-6等炎性因子的转录水平，从而抑制HUVEC细胞分泌水平。同时，本研究还检测了炎症重要调节因子NF-κB的上游调控miRNA——miR-181b的mRNA水平，发现LIG中、高浓度组可以明显降低NF-κB的水平和增加miR-181b的水平，因此推测LIG可能会通过调节NF-κB表达起到抗炎作用。

表2 各组细胞存活率及凋亡率Table 2 Viability and apoptosis rate of HUVEC in each group

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01；与对照组相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表3 各组细胞内炎性因子的含量Table 3 Levels of inflammatory cytokines in HUVEC of each group

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01；与对照组相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表4 各组细胞内炎性因子及miR-181b mRNA相对表达量Table 4 mRNA levels of inflammatory cytokines and miR-181b in each group

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01；与对照组相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表5 各组细胞内炎性因子的浓度Table 5 Concentration of inflammatory cytokines in HUVEC of each group

注：与ox-LDL组相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the ox-LDL group,**P< 0.01.

2.4 藁本内酯对HUVEC内NF-κB蛋白表达的调控

本研究采用Western blotting法检测了细胞内NF-κB的蛋白水平，结果显示，ox-LDL能显著增加NF-κB蛋白表达，而LIG则能明显降低其表达，与模型组相比差异有显著性(P< 0.01，图2)。为进一步探讨LIG对HUVEC内NF-κB调节机制，本研究采用miR-181b mimics或miR-181b inhibitor分别激活或抑制细胞内miR-181b表达，结果发现，miR-181b mimics可以明显抑制炎症因子TNF-α、IL-6及NF-κB水平，而miR-181b inhibitor结果刚好相反，并且miR-181b inhibitor削弱了LIG对HUVEC细胞炎症因子的调控作用(P< 0.01，表5)，提示LIG很可能通过上调miR-181b表达，从而下调NF-κB表达，抑制细胞内炎症反应。

注：C：对照组；M：模型组；LH：藁本内酯高浓度组；LM：藁本内酯中浓度组；LL：藁本内酯低浓度组。图2 各组细胞内NF-κB的蛋白含量Note. C: Control group; M: Model group; LH: High concentration of ligustilide group; LM: Medium concentration of ligustilide group; LL: Low concentration of ligustilide group.Figure 2 NF-κB protein level in HUVEC of each group

3 讨论

动脉粥样硬化(AS)是一种主要累及大中弹力血管的慢性、进行性、炎症性疾病。炎性反应存在于AS的各个阶段，从血管内膜的脂质沉积、斑块形成、进展、再到破裂，血栓形成，核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是调节炎症最重要的转录因子。因此，抑制NF-κB信号可以延缓AS斑块的进展[8-9]。

ox-LDL既可以诱导血管内皮细胞炎症及氧化损伤，导致其功能降低。同时，ox-LDL还可以促进单核细胞分化成向巨噬细胞，并与巨噬细胞膜上的特异性受体Lox-1结合进入细胞内，越来越多的ox-LDL不断被转运至巨噬细胞内后即形成泡沫细胞，大量泡沫细胞堆积到血管内壁即形成AS镜下可见的最早病变——脂纹[10-11]。本实验中，ox-LDL可促进HUVEC细胞分泌TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1增多，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。说明ox-LDL可明显诱导HUVEC出现炎症样损伤。

冠心病病人血清中TNF-α及IL-6的水平显著高于正常人群，而在AS小鼠的血清中二者水平也明显高于对照组小鼠，可以作为AS小鼠炎症的血清标记物。血中TNF-α及IL-6浓度增高一方面可进一步增强血管及斑块局部的炎症反应，另一方面可不断刺激血管内皮细胞，导致其生理功能受损，血管壁最内层的保护屏障被破坏，从而使得大量炎性细胞迁移、沉积于此。ICAM-1与VCAM-1可介导循环系统中白细胞特别是单核细胞与活化血管内皮细胞黏附并迁移聚集于内膜下，过度摄取脂质形成泡沫细胞，大量的泡沫细胞堆积逐渐形成粥样斑块[12-13]。

越来越多的研究表明，很多清热解毒及活血化瘀类中药都具有抗AS的功效，比如三七、丹参、黄连、虎杖、当归等[14-16]。藁本内酯即是从中药当归、川芎中提取分离出的活性成分，动物实验表明其具有抗AS损伤作用，然而其机制尚不明确。本实验发现，藁本内酯具有保护HUVEC的药理作用。10、20、40 μmol/L LIG预处理细胞2 h，可显著减轻ox-LDL诱导的细胞炎症损伤。LIG不仅能促进HUVEC增殖，抑制其凋亡，还能降低细胞内TNF-α、IL-6、ICAM-1与VCAM-1等细胞因子的分泌，有效抑制ox-LDL诱导的细胞炎症反应。为探讨LIG抗炎的具体机制，本研究检测了HUVEC细胞内NF-κB及其上游miR-181b的表达水平。结果显示，ox-LDL能显著上调炎症调控关键环节NF-κB mRNA和蛋白的表达，同时下调miR-181b的mRNA水平。miR-181b被证实是NF-κB上游的重要调控基因，在多种细胞或组织中均能调节NF-κB的表达。为验证LIG是否通过miR-181b调节NF-κB表达，从而降低HUVEC细胞炎症反应，本研究分别采用miR-181b mimics或miR-181b inhibitor上调或下调miR-181b水平，再观察细胞增殖及细胞内炎性因子的分泌情况。数据显示，miR-181b mimics能显著减轻细胞损伤，降低炎性因子TNF-α、IL-6、NF-κB水平；miR-181b inhibitor则刚好相反。LIG和miR-181b inhibitor共同处理细胞后，削弱了LIG的细胞保护作用，同时增加了TNF-α、IL-6与NF-κB的浓度，说明LIG很可能通过上调miR-181b水平从而降低ox-LDL诱导HUVEC细胞炎症水平，NF-κB是这一过程的重要中间环节。

由于时间和经费限制，此次本研究未能在动物水平验证LIG抗AS的药理作用是否与调控miR-181b/NF-κB途径有关，这也将是本课题组后期工作的重要内容。