甘氨鹅脱氧胆酸对体外细粒棘球蚴原头节活力及ROS影响

，，，，，， ，容基，， ，

囊型包虫病(echinococcosis)又称细粒棘球蚴病(cystic echinococcosis， CE)，是由细粒棘球绦虫(Echinococcosisgranulosus，Eg)的幼虫阶段寄生于人体或者宿主动物而引起的疾病，在我国主要存在于新疆、青海等畜牧业发达的省区，已成为严重的公共问题[1]。细粒棘球蚴病主要影响肝脏和肺脏，发生率分别为50%～70%和20%～30%[2]。肝囊性包虫病治疗主要以手术为主[3]，但是，肝囊性棘球蚴病患者手术过程中，如果存在头节外漏或残腔残留，则会导致术后棘球蚴病的复发，因此亟需发现一种既能灭杀细粒棘球蚴原头节又对机体和周围健康肝组织损伤较小的药物。

近年来，许多研究发现，胆汁酸作用于肿瘤细胞后可明显抑制肿瘤细胞的活力，随着时间延长，浓度升高，抑制效果越明显[4-5]。本研究通过观察不同浓度甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid， GCDCA)对细粒棘球蚴原头节的活力及 ROS水平变化，希望为囊性棘球蚴病的治疗提供一个新的研究方向。

1 材料与方法

1.1材料 含细粒棘球蚴囊泡的羊肝买自新疆昌吉市屠宰场。甘氨鹅脱氧胆酸与caspase-3检测试剂盒均购于美国 sigma 公司；ROS 检测试剂盒购于南京建成公司；RPMI1640 培养基购自上海哈灵生物公司，胎牛血清购自四季青生物有限公司。

1.2原头节的体外培养 获取含细粒棘球蚴病囊泡的羊肝，用双蒸水及75%酒精分别清洗冲洗肝脏囊泡表面，在无菌条件下抽取含原头节的囊液置于培养瓶中，静置，抽掉上清，用 PBS(PH7.2)液洗涤4～6遍，用0.1%伊红染液做染色排斥实验，98%以上拒染时可用于实验。将原头节移至含10%胎牛血清的1640培养基(青霉素及链霉素各100 U/ mL)的培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3GCDCA作用于细粒棘球蚴原头节 将原头节分为空白对照组及500、1 500、2 500 μmol/L GCDCA 组。于无菌条件下用PBS 清洗体外培养后的细粒棘球蚴原头节至其活力≥98%；取六孔板，按照设置好的体系及分组加入相应培养基，每组培养基中加入约2 500个原头节，放于37 ℃、5% CO2条件下培养，从加药24 h开始，每天抽取100 μL培养液，用0.1%伊红染色法检测原头节活力并在倒置显微镜下观察计数。无活力或者活力差的原头节会被染成红色；活力较好的头节不被染色，且可活动。间隔3 d更换培养液，重新加药。实验重复3次。

1.4caspase-3的酶活力测定 取空白组及500、1500、2500 μmol/ L GCDCA组作用24 h后的细粒棘球蚴原头节，PBS清洗3次后。每3 mg原头节中加入120 μL裂解液，超声破碎(功率、时间、次数)，4 ℃ 12 000 g高速离心10 min后，抽取上清液。按照caspase-3检测试剂盒步骤将反应体系加入96孔板中，于37 ℃避光孵育，待颜色变化较明显时，用 Bio- RAD酶标仪检测吸光度(A405值)。实验重复3次。

1.5ROS水平的测定 收集空白组及500、1500、2500 μmol/L GCDCA 组作用24h 后的原头节，更换含DCFH-DA 10μmol/L 无血清培养基，37 ℃避光孵育1 h，弃培养液，PBS 清洗3次，静置，待自然沉淀后收集原头节，用Bio-RAD 荧光酶标仪检测DCFH OD 值，488nm 激发波长，525nm 发射波。然后用PBS清洗3次，并在荧光显微镜下观察原头节。实验重复3次。

1.6统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析(ANOVA) 和最小显著差法(LSD)检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1GCDCA作用原头节后活力的变化 GCDCA作用后的原头节活力曲线见图1。随着时间的延长，同一药物浓度下原头节存活率逐渐降低；在同一时间下，随着药物浓度的增加，原头节存活率也降低。由此可推测GCDCA诱导原头节死亡具有时间和浓度依赖性。

图1 不同浓度GCDCA作用原头节后活力值Fig.1 Inhibitory effects of GCDCA on in vitro E. granulosus protoscoleces

2.2GCDCA作用后原头节体内caspase-3 酶活性的变化 体外培养24 h 后的各组原头节分别进行caspase-3酶活性检测，结果如图2。在同一时间内，随着药物浓度的增加，caspase-3活性逐渐增强，GCDCA作用组同空白组比具有统计学意义(P<0.05)。对caspase-3活性检测数据进行单因素方差分析，组间比较有统计学意义(F=555.162，P<0.05)，以2 500 μ mol/ L GCDCA浓度组 caspase-3酶活性增加更显著。

注：* 与空白对照组比较，P<0.05。图2 GCDCA 作用24 h 后原头节caspase-3 酶活性变化Fig.2 Activity of caspase-3 in E. granulosus protoscoleces incubated with GCDCA for 24 h

2.3GCDCA作用后原头节内ROS 水平的变化 DCFH-DA 荧光染色后，GCDCA组原头节可见绿色荧光，ROS 的荧光强度随GCDCA浓度增加而增强见图3(A、B、C、D)，荧光酶标仪检测显示终浓度 500、1500、2500 μmol/LGCDCA 作用后 ROS 荧光强度分别为对照组 2.53、3.71、5.25 倍(F=216.901,P<0．05)，见图3E。

注：* 与空白对照组比较，P<0.05。A:空白对照组(×100), B:500 μM GCDCA 处理组 (×100), C: 1500 μM GCDCA 处理组 (×100), C: 2500 μM GCDCA 处理组 (×100), E: ROS 荧光强度。图3 GCDCA 作用24 h 后原头节ROS水平变化Fig.3 Impact of GCDCA on ROS level in E. granulosus protoscoleces after 24 h post-incubation

3 讨 论

囊性棘球蚴病可发病于机体的多个部位，肝脏是主要受累器官[2]。阿苯达唑是目前国际上公认的灭杀原头节的药物[6]，但临床上应用效果并不理想，长期口服阿苯达唑会引起如肝损伤及胃肠道功能紊乱等不良反应[7]。因此，寻找一种安全、有效的灭杀原头节的新型药物对于治疗及预防肝包虫病术后复发具有重要的意义。

据相关文献报道，胆汁酸可以诱导结肠癌、前列腺癌等细胞凋亡[8-9]。胆汁酸具有的细胞毒性能破坏细胞质膜，诱导细胞内 ROS的产生，而 ROS可进一步增强胆汁酸的细胞毒性作用， 最终诱导细胞的凋亡[10]。有关文献报道，GCDCA 具有细胞毒性，能诱导肿瘤细胞的凋亡[11-12]。

本实验结果表明GCDCA 能抑制体外细粒棘球蚴原头节的存活，且随着药物浓度的增加，原头节的死亡率呈增高趋势。原头节的活力曲线显示2500 μmol/L GCDCA对原头节的抑制作用显著强于其他低浓度组(500、1500μmol/L GCDCA)。此外1500 μmol/L GCDCA 作用1 d 时原头节的存活率为61%，作用3 d 时其存活率下降到40%。提示GCDCA具有潜在的抗肝囊性包虫病作用。

在不同的病理过程中，由于许多的分子信号通路均可调节caspase-3，故caspase-3通常被当做凋亡的关键蛋白。本研究发现，GCDCA作用24 h 后caspase-3酶活性开始增加，2500 μmol/L GCDCA 增加最明显。该结果说明GCDCA能够明显诱导caspase-3的表达增加，这与史红娟等[13]的研究结果具有一致性。

许多病理过程发现有活性氧(ROS)的参与[14]。有关研究表明[15]，在体外研究条件下，过量的ROS 能够导致线粒体结构受损，产生凋亡诱导因子，从而激活下游的caspase途径，诱导细胞凋亡。在本研究中，我们观察到细粒棘球蚴原头节早期就能够产生ROS。在用 GCDCA处理后24 h后，我们观察到细粒棘球蚴原头节内 ROS明显增加，并且随着 GCDCA浓度的增加，原头节内 ROS的水平也明显的升高。原头节内ROS的产生和增加程度同casapse-3的激活和升高趋势是一致的。

目前，许多研究证实 ROS与肿瘤细胞凋亡之间存在联系，细胞内 ROS水平的变化可引起凋亡相关信号通路发生变化，最终激活 caspase-3；ROS 产生先于caspase-3的活化，提高肿瘤细胞内ROS水平能抑制肿瘤细胞生长[16-17]。本实验结果发现 GCDCA能明显提高原头节内 ROS水平，这提示 ROS可能参与 GCDCA诱导细粒棘球蚴原头节凋亡过程，但进一步相关作用途径有待进一步研究。