联合X染色体多类遗传标记应用于同父姐妹亲缘关系鉴定实例

巩五虎，薛少华，张 岩，林 源

（1.西安市公安局刑事侦查局技术处，陕西 西安 710038；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063）

1 案例

1.1 简要案情

两名女性（全文用A和B进行标示）要求进行同父姐妹亲缘关系鉴定，父母均已过世，且无任何其他直系亲属，无任何身份证明文件，如出生记录、户口记录等。

常规检测手段为采用X-STR检测试剂盒对上述两名个体DNA样本进行分型检测。采用商业化检测试剂盒Investigator X-12试剂盒（德国凯杰公司）对12个X-STR基因座进行分型检测[1]。检测结果发现基因座DXS8378和HPRTB存在突变的可能性，分型信息见表1。由于基因座DXS8378和HPRTB分别为X染色上连锁群1和连锁群4的核心基因座，国内市场上推出的Goldeneye 17X试剂盒（北京基点认知生物有限公司）含有上述两个基因座。两个试剂盒检测结果表明，相同基因座检测结果一致，新增加的X-STR基因座分型在A和B个体中均检见一个相同的等位基因。该案例依据现有检测手段，无法做出肯定性的判断结果。

表1 两名女性个体（A和B）在12个X-STR基因座的分型结果

1.2 X-InDel位点的检测信息

采用含有18个X染色体上Indel（Insertion-Deletion，Indel）位点的复合扩增体系对上述两份DNA样本进行分型检测[2]。该复合扩增体系及应用已获专利授权（ZL 2013 1 0161815.3）。PCR反应采用10μL扩增体系，其中，包括PCR反应缓冲液2 μL，引物混合物 1 μL，DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 0.5 ng，其余体积用去离子水补齐。反应体系在9700 PCR仪上进行扩增，PCR扩增参数为：95℃15 min；94℃30 sec、65℃90 sec、72℃、90 sec，共进行 30 个循环；60℃延伸60 min。PCR产物变性后在3130XL遗传分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行毛细管电泳，采用已授权分型文件进行等位基因结果判读。两份样本在18个X-Indel的分型均检见一个相同的等位基因。

1.3 X-SNP位点的检测信息

为进一步获取遗传信息量，以更好地做出结果判断，尝试采用已完成验证的高通量并行测序（Massive parallel sequencing， MPS）体系对 29个 XSNP位点进行分型检测[3]。测序在Ion Torrent PGM（美国Thermo Fisher Scientific公司）完成，主要步骤包括文库构建、文库修饰及定量、文库富集及定量、芯片loading及测序、数据分析。两份样本在29个X-SNP位点分型均检见一个相同的等位基因。

1.4 基于MPS技术对X-STR测序检测

针对Investigator X-12试剂盒中包含的12个X-STR基因座进行MPS文库构建引物设计，其中DXS10134、DXS10079和 DXS10148基因座无法获取理想的文库构建引物，其余9个STR基因座引物信息见表2。测序在Ion Torrent PGM平台进行，采用“PGM:Ion PGMTMTemplate OT2 400 Kit for Hi-QTM”模式进行400 bp文库测序，芯片为314 V2。测序发现样本A和B在9个X-STR基因座上检见的相同等位基因序列结构一致，如DXS10101基因座相同等位基因29.2的序列结构均为[AAAG]3GAAAGAAG[GAAA]3A[GAAA]4AAGA[AAAG]5AAAAAGAA[AAAG]14AA，其中黑色加粗的碱基不纳入重复结构计算[4]。

2 讨论

由于女性个体含有两条X染色体，男性个体只有一条X染色体，故X染色体遗传标记具有伴性遗传的特征，表现为性连锁遗传，以单倍体形式遗传给子代，即母亲可将两条X染色体上的等位基因随机地遗传给子女，而父亲X染色体上的等位基因则只能遗传给女儿[1-2]。理论上同父姐妹样本在X染色体上遗传标记必然会检见一个相同的等位基因。本案例特殊之处在于对X染色体上12个STR基因座的检测中发现，其中两个X-STR基因座基因分型均为纯合子，存在一步突变的可能性。目前对于X染色体上遗传标记的法医学检测试剂盒仅针对STR基因座展开，最多可以检测17个X-STR基因座。为确保基因分型不存在等位基因漏检现象，采用含有上述两个基因座的其他生产厂商推出的试剂盒进行验证。另外，对于X-STR遗传标记的亲权关系计算，无统一的算法及相关标准。当遇到类似本案例情况时，如何进一步增加遗传信息检测，获取更为科学可靠的法医学证据，值得进一步研究。

表2 9个X-STR文库构建引物信息

本案例尝试采用自行研发的基于毛细管电泳技术的X-Indel复合扩增体系对上述突变案例样本进行了X染色体上遗传信息的补充检测，检测结果不排除A与B个体属于同父姐妹关系。Indel遗传标记可分为插入和缺失两种等位基因形式，本质上也属于SNP位点，但是由于存在长度差异，可以在法医学实验室必备的遗传分析仪上完成检测，该技术易于在基层法医DNA实验室推广。

另外，本研究采用MPS技术对X-SNP位点和X-STR基因座进行了测序检验。SNP在遗传分析仪上采用SNPshot技术也可以完成，但是由于荧光素限制，对于引物设计存在梯度长度排布的要求，且应用于降解检材效果不佳[5]。本次对29个X-SNP位点进行150bp以下的文库构建，测序效果较好，且适用于降解检材。检测中可以对样本进行并行检测，且可以根据样本数量进行不同容量芯片的选择，最大程度上节约样本。采用MPS技术对9个常用X-STR基因座进行并行测序检测，检测结果发现A与B个体在9个基因座上检见的相同等位基因具有相同的序列结构，且测序序列上变异信息一致，进一步增加了遗传证据。

上述检测实例为如何在常规X-STR基因座检测发生突变情况时进一步获取遗传证据提供了新的遗传标记及新的技术手段。其中MPS技术在多位点、多样本的并行检测中展现出了优势，为法医学遗传标记的高效检测提供了一种新的思路，为非常规亲缘关系鉴定提供了新的技术手段。