普通PCR技术和高灵敏HBV-DNA技术检测乙肝病毒DNA的研究

邬俊勇，张小莲，江光荣，揭羽青，潘金平，欧阳致成

（1.宜春市人民医院检验科，江西 宜春 336000；2.宜春市人民医院输血科，江西 宜春 336000；3.宜春市人民医院肝病科，江西 宜春 336000）

慢性乙型肝炎也叫乙肝，是指乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）检测阳性，是临床上常见的传染性疾病，可通过血液和唾液传播。主要临床表现为恶心、乏力、腹胀和肝区疼痛等[1-2]。据统计，我国大约有1亿的人为乙肝病毒携带者，两千万慢性乙型肝炎患者，是我国社会负担最大的疾病之一[3-4]。目前，临床上对乙肝疾病的检测主要是乙肝病毒血清标志物（HBV-M）检测，反应的是人体对乙肝病的免疫状态，以不同血清学模式代表不同的意义[5]。随着分子生物学技术的兴起，聚合酶链式反应（PCR）和高灵敏HBV-DNA技术在乙肝病毒检测上获得了广泛的应用[6-7]。本研究以临床收治43例肝炎患者为研究对象，采用普通PCR进行定性检测和高灵敏HBV-DNA技术进行定量检测，探讨两种技术在乙肝病毒检测上的应用价值，以方便知道临床诊断、用药和预后判断。

1 材料与方法

1.1 临床资料 以2016年1月～2017年8月宜春市人民医院收治的43例肝炎患者为研究对象。Spectra Max M5e多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司）]，JY-96G梯度基因扩增仪(武汉华科达实验设备有限公司)，DA7600全自动荧光检测系统(中山大学达安基因股份有限公司)。乙肝两对半抗体酶联免疫诊断试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)。乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（广州达安基因股份有限公司），乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒（广州达安基因股份有限公司）。

1.2 方法 乙肝病毒血清标志物检测：ELISA检测过程严格按照乙肝两对半抗体酶联免疫诊断试剂盒说明书进行，使用Spectra Max M5e多功能酶标仪进行读数和结果判定。

普通PCR检测：按照乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒说明书进行。扩增条件如下：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，40～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环。使用JY-96G梯度基因扩增仪进行基因扩增，电泳检测。

高灵敏HBV-DNA检测：严格按照乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明书进行，高灵敏乙肝HBV-DNA技术：采用通用硅基捕获技术，在Cobas Amp-liPrep仪器上进行自动化样品制备，转移至COBAS Taqman48仪器，使用实时PCR技术自动扩增并检测。若样品的C＜20,则该样品的HBV浓度＜20IU/ml，若样品的20≤C≤1.70E+008,则该样品的HBV-DNA浓度=CIU/ml，当结果大于1.70E+008IU/ml，表示高于最高检测上限需稀释后再次进行检测。

1.3 观察指标 以血清标志物组合为考察指标，对普通PCR和高灵敏PCR技术的扩增结果进行对比分析。

1.4 统计学方法 本研究数据均用SPSS 20.0统计软件处理，计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种技术的阳性率比较 使用普通PCR技术和高灵敏PCR技术对43份肝炎患者的血清进行乙肝病毒检测，从检测结果上看，普通PCR检测的阳性率是0，高灵敏PCR检测的阳性率是46.5%，两种方法的检测结果对比差异有统计学意义（χ2=15.24，P=0.034＜0.05），见表1。

表1 普通PCR和高灵敏PCR检测结果比较Table 1 Comparison of detection results of common PCR and high sensitive PCR

2.2 两种检测方法与血清标志物检测结果的比较 在血清标志物检测的15例“大三阳”血清样本中，普通PCR仅检测出0例阳性，阳性率为0，高灵敏PCR检测出10例阳性，阳性率66.67%，阳性率对比差异具有统计学意义（χ2=9.24，P=0.143＜0.05）；13例“小三阳”血清样本中，普通PCR仅检测出0例阳性，阳性率为0%，高灵敏PCR检测出7例阳性，阳性率53.85%，阳性率对比差异具有统计学意义（χ2=9.12，P=0.157＜0.05）；8例“小二阳”血清样本中，普通PCR仅检测出0例阳性，阳性率为0%，高灵敏PCR检测出3例阳性，阳性率37.5%，阳性率对比差异具有统计学意义（χ2=8.34，P=0.017＜0.05），见表2。

表2 两种PCR检测方法与血清标志物检测结果的比较Table 2 Comparison of two PCR detection methods with serum marker detection results

3 讨论

乙肝病毒血清标志物检测是临床上最常用的检测方法。感染病毒时出现多种免疫应答过程，得到不同的结果组合，该检测虽能定性检测到乙肝表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体和核心抗体的阴性或者阳性结果，但并不能反应出病毒在患者体内的复制情况和传染程度，无法指导临床用药和治疗[8]。随着分子生物学的兴起，荧光定量PCR技术在乙肝病毒检测过程中，可以直接反映出病毒的复制情况，具有快读、特意、灵敏度高的优势，在临床上获得广泛的关注。姚兆基[9]采用实时荧光PCR法检测76例乙肝患者的结果可见，大三阳的检出率最高，达到96.15%，显著高于其他的组合，作者通过研究认为，RT-PCR和ELISA法联合可提高临床的诊断率，为药物治疗提供参考。本研究中，普通PCR检测的阳性率是0%，高灵敏PCR检测的阳性率是46.5%，两种方法的检测结果对比差异具有统计学意义（p＜0.05）；在血清标志物的检测结果组合中，高灵敏PCR检测的“大三阳”、“小三阳”和“小二阳”的阳性率都显著高于普通PCR的检测结果，这和文献报道的结果一致[10]。

综上所述，与普通PCR相比，高灵敏PCR法可以检测出患者的免疫状况和病毒传染性的强弱，而且灵敏性更高，可用于指导临床患者用药和判断预后。