RNA-SAT在儿童肺炎支原体肺炎诊断中的价值

张书婉,徐 蓓,吴 爽,黄君华

(1西安市儿童医院检验科,西安 710003;2西安医学院医学技术系)

肺炎支原体肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia, MPP)是儿童最常见的呼吸道感染性疾病[1],占儿童社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的20%左右[2]。肺炎支原体(MP)感染常会导致儿童凝血功能紊乱[3]和中枢神经系统症状[4],是5岁以下儿童死亡的首位病因。另外,由于诊断不明确的MPP而增加经验性用药,导致大环内酯类抗菌药物的耐药菌株居高不下[5]。MP感染人体后症状不典型,部分患儿无明显临床症状,给儿科临床医师的早期诊断带来困难。目前,MPP的实验室检查主要依靠血清学方法(检测MP-Ab),但MP-Ab一般在感染后4-5 d才出现,且持续存在时间较长,对于早期诊断及疗效观察意义不大,因此急需一种快速准确的早期检测方法。RNA恒温扩增技术(RNA simultaneous amplification and testing,RNA-SAT)是新一代活菌检测技术,特点是窗口期短,快速准确,可辅助判断预后和治疗效果,已应用于结核分枝杆菌、肠道轮状病毒等多种病原体的检测[6],效果良好。近年来SAT也开始应用于儿童MPP检测,但对其临床应用价值的研究国内报道较少。本研究通过将RNA-SAT检测结果与常规MP-Ab结果相比较,旨在探讨RNA-SAT对MPP的早期诊断价值,为RNA-SAT的推广应用提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

回顾性分析2017-06～2017-12西安市儿童医院收治的因社区获得性肺炎(CAP)住院的患儿221例,将其分为MPP组(75例)和非MPP组(146例)。非MPP组包括病毒性肺炎78例,细菌性肺炎47例,细菌和病毒混合感染的肺炎6例,百日咳15例。

MPP组入选标准参考《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》[7]和《儿童社区获得性肺炎管理指南(2013年修订版)》[8],满足以下条件:①存在以发热、干咳为主的呼吸道症状;②体征不明显,可有干、湿啰音或呼吸音低等;③胸片大片高密度影、支气管肺炎或间质性肺炎表现;④单次血清抗体滴度≥1 ∶160。

非MPP组入选标准:①存在确切的其他病原体感染的证据,如病毒、肺炎链球菌等;②住院期间血清MP抗体滴度≤1 ∶160。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 221例纳入研究的患儿均在入院当日采集静脉血和咽拭子送检,其中静脉血经3 000 r/min离心5 min后取血清检测肺炎支原体抗体。咽拭子采集后立即送检,用于肺炎支原体RNA检测。

1.2.2 MP-Ab检测(被动凝集法) 患儿血清标本应用日本富士瑞必欧株式会社赛乐迪亚试剂盒检测肺炎支原体抗体(步骤见试剂盒说明书)。结果判读:MP-Ab滴度≥1 ∶160为阳性。

1.2.3 RNA-SAT检测 将咽拭子头放入1 ml生理盐水浸泡贴壁挤干,然后吸取0.5 ml该生理盐水到1.5 ml离心管中,再加入0.5 ml裂解液,震荡混匀,4-8 ℃暂存。应用上海仁度生物科技有限公司MP-SAT试剂盒提取待测样本RNA(步骤参见试剂说明书),后转至荧光定量PCR仪扩增。结果报告为阳性/阴性,阈值设定以阈值线超过正常阴性对照曲线的最高点为准。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件。RNA-SAT与MP-Ab两种方法敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值之间的比较采用两独立样本χ2检验,P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床标本检测结果

表1结果显示，MPP组仅有RNA-SAT阳性23例,占30.7%(23/75);仅有MP-Ab阳性22例,占29.3%(22/75);RNA-SAT和MP-Ab均为阳性26例,占34.6%(26/75);二者均阴性4例,占5.3%(4/75),这4例患儿肺泡灌洗液MP-DNA检测阳性,结合临床表现诊断为MPP。

非MPP组仅有MP-Ab阳性25例,占17.1%(25/146),可能为既往感染;仅有RNA-SAT阳性3例,占2.1%(3/146);RNA-SAT和MP-Ab均为阴性118例,占80.2%(118/146),无二者均阳性病例(见表1)。两种检测方法结果不一致的比例在MPP组和非MPP组分别为60.0%(45/75)和19.2%(28/146)。

表1临床标本221例RNA-SAP和MP-Ab检测结果(例)

Table1TheresultsofMPPin221clinicalsamplesbyRNA-SAPandMP-Abassays(cases)

检测结果MPP组非MPP组合计RNA-SAT(+)MP-Ab(-)23326RNA-SAT(-)MP-Ab(+)222547RNA-SAT(+)MP-Ab(+)26026RNA-SAT(-)MP-Ab(-)4118122合计75146221

2.2 RNA-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性分析

比较两种方法在敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值上的差异,通过统计学分析发现:二者在敏感性和阴性预测值上差异无统计学意义(P>0.01),在特异性和阳性预测值方面差异具有统计学差异(P<0.01,见表2)。说明SAT较血清学方法的特异性更好,RNA-SAT阳性结果更能表明患儿感染了MP。

表2RNA-SAP和MP-Ab诊断MPP的准确性分析

Table2TheaccuracyanalysisofdiagnosingMPPbyRNA-SATandMP-Ab

指标 RNA-SAP MP-Abχ2P敏感性65.3%(49/75)64.0%(48/75)0.02>0.01特异性97.9%(143/146)82.9%(121/146)15.75<0.01阳性预测值94.2%(49/52)65.8%(48/73)26.43<0.01阴性预测值84.6%(143/169)81.8%(121/148)1.16>0.01

3 讨论

肺炎支原体(MP)是儿童社区获得性肺炎(CAP)常见病原体,肺炎支原体肺炎(MPP)在学龄期儿童最为高发[2]。MPP发病后症状和影像学表现不典型,实验室检查对该病的确诊尤为重要。目前实验室早期诊断MP主要依靠血清学(如MP-Ab)检测,但其阳性率受患儿年龄、病程、机体免疫状态、应用抗菌药物等多种因素的干扰,易导致漏诊或误诊。RNA-SAT作为新一代RNA活菌检测技术,能即时反映感染情况、辅助判愈,缩短窗口期,避免假阳性、准确度高,可以区分“死菌”和“活菌”,更适用于MP的早期诊断。另外,血清学检查需采集静脉血,属有创操作,对于儿童较为困难;而SAT采用无创性的咽拭子标本,儿童的依从性更好。

本研究选取临床诊断为CAP的221例患儿为研究对象,包括75例MPP,其中4例RNA-SAT和MP-Ab检测均阴性(入院前有阿奇霉素治疗史,其肺泡灌洗液DNA定量检测阳性且此后应用阿奇霉素治疗有效),22例RNA-SAT(-)MP-Ab(+)病例中有2例检测前应用过阿奇霉素;146例非MPP,其中RNA-SAT(+)3例,MP-Ab(+)25例(其抗体滴度均<1 ∶160)。通过研究发现RNA-SAT检测的敏感性和特异性分别为65.3%和97.9%。周杰等[9]报道以荧光定量PCR为参照,RNA-SAT的相对敏感性为88.9%,较本研究高,可能与定量PCR产生的假阴性有关;特异性(99.5%)与本研究(97.9%)相近。冯雪莉等[10]以MP-Ab结果为标准,显示RNA-SAT的敏感性为75.0%,特异性为89.7%;郭丽等[11]研究SAT诊断MP感染的敏感度和特异度分别为83.6%和97.3%。造成不同研究RNA-SAT检测方法的敏感性和特异性不同的原因主要是对MPP真阳性和非MPP真阴性的纳入标准不同,本研究的纳入标准均以患儿出院后最终临床诊断(综合临床表现、影像学和实验室检查)为准,而不是以某一实验室检测方法为准,最大限度排除了假阴性和假阳性,所得结果更为可靠。在MPP组和非MPP组分别有60.0%和19.2%的患儿两种方法结果不一致,显示在MPP诊断中二者的一致性较差,这与冯雪莉等[10]的报道相同。

通过方法学比较我们发现RNA-SAT和MP-Ab的敏感性分别为65.3%和64.0%,这与冯雪莉等[10]的报道一致;特异性分别为97.9%和82.9%,说明SAT检测阴性能更好地排除MP感染。阴性预测值分别为84.6%和81.8%,无统计学差异(χ2=1.16,P>0.01);阳性预测值分别为94.2%和65.8%,差异有统计学意义(χ2=26.43,P<0.01),说明SAT阳性结果提示儿童感染MP的概率更高。

另外,郭丽等[11]研究表明SAT与MPP的疾病严重程度相关,SAT结果可作为评价MPP转归及大环内酯类药物停药的指标。本研究中有4例MPP患者入院前有阿奇霉素治疗史,RNA-SAT和MP-Ab检测均为阴性,停药后症状未得到控制,又进一步应用大环内酯类药物治疗。但是否SAT结果的转阴便可作为临床停用大环内酯类药物的指标还有待进一步验证。

综上所述,由于儿童免疫功能尚未发育完善,MP感染的临床表现不典型,单独使用抗体检测可能存在较大漏诊或误诊风险,在未明确诊断时,经验性用药可能增加抗生素的耐药风险。采用SAT技术能缩短MP检测窗口期,可区分“活动性感染”和“潜伏感染”,具有更高的特异性和阳性预测值,在儿童MPP的早期诊断中有较高价值,可有效辅助临床的早期明确诊断。