健康人和T-ALL患者BCL11B-3’UTR miRNA结合位点区域的单核苷酸多态性/突变情况*

陆 帅， 何子凡， 廖紫薇， 曾成武， 杨力建， 陈少华， Suming HUANG， 李扬秋△

(暨南大学 1再生医学教育部重点实验室， 2基础医学院血液学研究所， 广东 广州 510632；3佛罗里达大学医学院生化与分子生物学系， 美国 佛罗里达州 盖恩斯维尔 326100245)

T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一类恶性程度高、疗效差、预后不良的血液肿瘤[1]。由于T细胞在发育和分化时涉及T细胞受体重排和基因重组过程，导致T-ALL发病机制非常复杂。国外学者和我们的前期研究均发现B细胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukemia 11 B，BCL11B)在T细胞肿瘤中异常高表达，下调BCL11B的表达可抑制白血病T细胞增殖并诱导其凋亡，提示BCL11B在T细胞肿瘤发生发展过程中起重要作用[2-6]。BCL11B异常表达的分子机制尚不明确，BCL11B基因异常重排和编码区突变仅见于个别病例，而其表观调控情况研究甚少[7-8]，故本研究首先分析健康人和T-ALL患者细胞中BCL11B基因 3’端非翻译区(3’-untranslated region, 3’UTR)微小RNA(microRNA, miRNA)结合位点区域单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和突变情况，了解其是否在BCL11B表达异常中发挥调控作用。

材 料 和 方 法

1 样本

本研究选取经细胞形态学和细胞免疫表型分析确诊的T-ALL病人21例(男17例，女4例; 年龄7～45岁，中位年龄22岁)及健康体检人员20例(男9例，女11例; 年龄20～74岁,中位年龄32岁)，收集EDTA-K2抗凝静脉血2～3 mL,按常规方法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，同时，收集本实验室保留的2种白血病T细胞株(CCRF-CEM细胞和Molt-4细胞)及1种白血病B细胞株(Raji细胞)，分别提取DNA用于后续研究。

2 BCL11B-3’UTR主要miRNA结合区域预测和引物设计

从NCBI-GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取BCL11B-3’UTR序列信息，BCL11B-3’UTR位于第4外显子上，全长共4 864 bp。通过TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)和RegRNA 2.0 (http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)等生物学软件分析miRNA结合位点，并根据预测的主要miRNA结合位点区域，使用Primer Premier 5.0软件设计4对引物(表1)，用于PCR扩增相应基因片段，分析其核苷酸序列。

表1 用于扩增BCL11B-3’UTR区域的引物序列

3 PCR

利用所设计4对引物分别采用PCR扩增每一个样本，每个PCR反应体系为30 μL: ddH2O 13.2 μL，5×PCR Buffer 6 μL，dNTP(1 mmol/L)3 μL， MgCl2(15 mmol/L) 3 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，基因组DNA 1.5 μL (约100 ng)。阴性对照加入等体积ddH2O。PCR在PCR扩增仪中进行，反应程序为： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s、60 ℃(扩增片段3的PCR中退火温度为61 ℃)1 min、72 ℃ 1 min，循环34次；最后72 ℃ 10 min。扩增所得产物使用1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物大小和特异性，选取阳性PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行核苷酸序列分析。

结 果

1 BCL11B-3’UTR miRNA结合位点预测结果

TargetScan和RegRNA 2.0软件分析全长4 864 bp的 BCL11B-3’UTR，发现其中存在多个潜在miRNA结合位点，根据seed match类型和context++ score等评价标准(评分>90)筛选得到24个高度保守的潜在miRNA结合位点，其中已有部分报道有SNP，见表2[9]。

2 BCL11B-3’UTR miRNA结合位点片段扩增结果

由于BCL11B-3’UTR序列过长且含有多个多聚腺苷酸结构，难以一次性扩增全长片段和进行核苷酸序列分析，因此本研究根据表1中高度保守的miRNA结合位点的分布分别设计4对引物扩增相应片段(66～830 bp、1 365～1 993 bp、2 079～2 988 bp和4 369～4 731 bp)，所扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，结果显示产物片段大小与预期一致，见图1。

表2 BCL11B基因3’UTR的miRNA结合位点

Figure 1. Analysis of PCR amplification products by agarose gel electrophoresis. M： 100 bp DNA ladder； 1～4: PCR products amplified from healthy DNA samples using 4 primer pairs, respectively. The size of PCR products were consistent as expected 655 bp, 629 bp, 910 bp and 363 bp, respectively.

图1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析结果

3 健康人和T-ALL患者BCL11B-3’UTR miRNA结合位点核苷酸序列分析结果

利用特异性引物扩增包含BCL11B-3’UTR miRNA预测结合位点的4对引物，对所收集的21例T-ALL病人和20例健康人基因组DNA进行扩增，绝大部分样本均可扩增到所有4个基因片段产物，但部分样本未能扩增到1～2个基因片段产物，所扩增的PCR阳性产物直接进行核苷酸序列测序分析，并使用MEGA 6序列分析软件对样品测序结果和基因库中BCL11B-3’UTR参考序列进行比对分析，结果显示：20例健康人及CCRF-CEM、Molt-4和Raji细胞株的BCL11B-3’UTR中所检测的区域均未发现SNP和突变情况，而在21例T-ALL样本中，仅发现1例存在BCL11B-3’UTR第2 402位点发生核苷酸替换(T>C)，该突变属于NCBI-dbSNP数据库登记的SNP(rs184678181)，登记突变频率为0.000 2,见图2。

Figure 2. Sequencing analysis results from part of BCL11B-3’UTR. Left figure: nucleotide sequence between segment of 2 400～2 407 bp ofBCL11Bgene from 8 samples, and T>C was showed in No.5 sample from a patient with T-ALL； right figure: results of sequencing, arrows indicated the wild type (TT) and heterozygous mutation (TC) position.

图2BCL11B-3’UTR部分核苷酸序列分析结果

讨 论

BCL11B基因定位于14号染色体长臂14q32.31位点，与T细胞受体(T-cell receptor,TCR)α/δ基因座相邻，主要表达于T细胞、胸腺细胞和脑组织中。BCL11B mRNA为7 623 bp(编码区268～2 739 bp)， 编码蛋白为824氨基酸[10]。有关BCL11B定向调控靶点的研究不多，有一研究显示了BCL11B表达受其下游850 kb的一个 1.9 kb区域顺式调节元件与其启动子近端相互作用而调控[11]。有关BCL11B-3’UTR下游调控的研究罕见，有一报道是在神经系统研究中发现miR-9/9(*)和miR-124与BCL11B等基因调控相关[12]。而在正常T细胞和T细胞肿瘤中，尚未见有关报道。基于BCL11B在T细胞发育分化以及T细胞肿瘤发生发展中的作用，分析其可能的调控靶点显得非常重要。本研究首先利用TargetScan和RegRNA 2.0软件分析BCL11B-3’UTR的潜在miRNA结合位点，并根据seed match类型和context++ score等评价标准，以评分>90筛选获得24个高度保守的潜在miRNA结合位点，在此基础上，我们设计相应的4对引物，扩增覆盖这些位点的基因片段，也同时覆盖了部分评分较低的miRNA结合位点。

从20例健康人样本的分析结果看，这些BCL11B-3’UTR主要miRNA结合位点区域均高度保守，未发现任何基因多态性和突变情况。在2种常见的白血病T细胞株CCRF-CEM和Molt-4中也均未发现多态性改变。而在21例T-ALL样本的分析结果也相似，仅在1例(4.76%)T-ALL样本发现BCL11B-3’UTR中第2 402位点发生核苷酸替换(T>C)，该突变可在NCBI-dbSNP数据库登记资料查到属于一种SNP(rs184678181)，其频率为0.000 2，但尚未在健康人和病人样本的研究中报道。本研究在21例T-ALL中发现1例存在该SNP，虽然发生频率为4.76%，但由于样本数较少，还有待进一步大样本分析研究。尽管该SNP位点不在我们预测的24个高度保守的潜在BCL11B-3’UTR的miRNA结合位点，我们进一步分析BCL11B-3’UTR中评分低于90的miRNA位点发现，BCL11B-3’UTR第2 399～2 405位点为hsa-miR-6814-5p的结合位点，其评分为88，接近90分，也属于较高保守的潜在miRNA结合位点，其改变也可能存在对BCL11B的影响，但仍有待进一步确定其对BCL11B表达的调控作用。

既往研究中，有报道T细胞肿瘤中存在BCL11B基因突变和重排情况，如在一例伴有t(6;14)(q25;q32)混合型(T细胞和髓细胞)急性白血病中，28S核糖体DNA基因(RN28S1)与BCL11B重排形成一个新的融合基因，与RN28S1相关的融合基因都发挥促肿瘤发生的作用，而在一个102例T-ALL的研究中，发现BCL11B的第4外显子出现高突变频率(14%)[13-14]。但这些研究主要涉及BCL11B编码区的改变，对于T-ALL中普遍性BCL11B高表达的机制，仍需进一步从BCL11B调控因素改变的角度加以认识。