中药骨蚀灵胶囊对早期兔激素性股骨头坏死的干预作用

范武 于雪峰 任向楠 陈凯云

1南昌大学（南昌 330003）；2南昌大学第四附属医院（南昌 330003）；3清华大学生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室（北京100084）

临床上部分患者因自身免疫性疾病等需要长期或过量使用糖皮质激素，导致激素性股骨头坏死（steroid⁃associated necrosis of the femoral herd，SANFH）的患病人数不断增加，严重影响患者的生存质量。目前关于SANFH的发病机制尚未明确，但有研究表明［1-3］脂质代谢紊乱为其发病的重要环节，过量激素的使用会造成大量的脂肪分解产物被释放进入血液循环，引起机体内血脂水平升高，血液变得黏稠，导致髓内的微型血管出现栓塞［4-5］，同时会诱导脂肪细胞堆积在髓腔，压迫腔内血管，造成股骨头缺血坏死［2，6］。中医学认为股骨头坏死当属“骨痹”“骨蚀”“血瘀”等范畴，其主要病因为瘀血阻滞、经脉不通，因此临床上常应用活血化瘀、补肾壮骨的方法治疗股骨头坏死，疗效确切，但有关激素诱发股骨头坏死的早期中药预防作用及机制的报道较少。本实验通过建立激素诱导的兔股骨头坏死模型，运用具有活血补气、补肾壮骨功效的中药复方骨蚀灵胶囊进行干预治疗，观察动物模型中的血脂水平改变特点及股骨头组织形态影像学变化，探究其可能的预防股骨头坏死的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年健康日本大耳白兔48只，体质量为（2.5± 0.3）kg，雌雄各半，实验兔子单独分笼、颗粒饲料喂养，由清华大学动物实验中心提供并在此完成实验，环境温度为20～25℃，明暗周期12 h/12 h。

1.2 药物及试剂 药物：骨蚀灵胶囊，0.27 g/粒，购于黑龙江中医药大学制药厂；醋酸泼尼松龙，125 mg/5 mL，购于浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33020824；洛伐他汀片，20 mg/片，购于北京万生药业有限责任公司，国药准字H10970092；青霉素钠，80万U/支，购于华北制药股份有限公司，国药准字H13020657。试剂：2700全自动生化分析仪Olympus配套的生化检测试剂。

1.3 分组 48只实验兔，耳缘静脉采血后血清血脂生化检查差异无统计学意义（P＞0.05）。适应性喂养1周后随机分成4组：对照组、模型组、骨蚀灵胶囊组、洛伐他汀组，每组12只。

1.4 造模和干预方法

1.4.1 造模 对照组在左侧臀部肌肉注射生理盐水，1 mL/只，每周2次，连续4周。其余3组每只兔子均在左侧臀部肌肉注射醋酸泼尼松龙注射液（10 mg/kg），1 mL/只，每周2次，连续4周。

1.4.2 干预方法 对照组：蒸馏水空腹灌胃15 mL，每日1次，连续4周。模型组：蒸馏水空腹灌胃15 mL，每日1次，连续4周。骨蚀灵胶囊组：骨蚀灵胶囊粉末，用蒸馏水调成90 mg/mL浓度的混悬液15 mL，空腹灌胃，每日1次，连续4周。洛伐他汀组：洛伐他汀片，磨成粉末后用蒸馏水调成200 μg/mL浓度的混悬液，15 mL，空腹灌胃，每日1次，连续4周。药物使用量均按人与兔体表面积换算公式计算。

1.5 主要设备和仪器 2700全自动生化分析仪：Olympus；200倍光学显微镜：Olympus；磁共振扫描仪：Philips 3.0T Achieve TX。

1.6 血清脂质生化检查 分别在第2、4周时间节点，各组均使用采血管从动物同一部位的耳缘静脉采血3 mL，室温静置4 h后离心（4 000 r/min，时间10 min），取上清液并使用全自动生化分析仪测定各组的总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的血清水平。

1.7 MRI检查 第4周，各组选取2只兔子在核磁检测前用1%戊巴比妥钠（3 mL/kg）静脉注射使动物镇静，核磁成像在清华大学生物影像中心完成，使用Philips 3.0T Achieve TX仪器进行双侧股骨头核磁扫描成像。

1.8 股骨头形态学检查 分别在第2、4周时间节点各组随机选取3只兔子，使用20 mL注射器进行空气栓塞法处死后，迅速取出双侧股骨头组织，在清洁干净的冰浴手术盘中用生理盐水进行冲洗干净，放入10%福尔马林溶液中固定脱钙，按照苏木精-伊红染色（HE）染色切片要求浸蜡包埋并切片观察。

1.9 统计学方法 使用SPSS 21.0统计学软件对本次实验中获得的血清脂质水平数据进行统计分析，总体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD⁃t检验，P＜0.05为差异有统计学意义，并使用Graph Pad Prism 5进行作图。

2 结果

2.1 第2周和第4周时各组的血清脂质检测结果 生化检测结果发现，与对照组相比，其余3组在第2周时的血清脂质均出现明显代谢紊乱，差异均有统计学意义（P＜0.01）；第4周时，与模型组相比，骨蚀灵胶囊组和洛伐他汀组的TC、TG以及LDL水平明显降低，且差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1、2。

表1 2周时各组兔血清TC、TG、HDL、LDL水平比较Tab.1 The levels of TC，TG，HDL，LDL in each group at 2 weeks（n=12） x ± s，mmol/L

2.2 各组兔股骨头HE染色的光镜检查结果 4周对照组：空骨陷窝少，骨小梁粗大完整，未见排列紊乱，骨细胞形态完好，无嗜酸性粒细胞聚集和脂肪细胞增生（图1A）；4周模型组：骨小梁纤细和断裂，走形紊乱，大量骨细胞出现萎缩变小，空骨陷窝增多，骨髓腔内可见脂肪滴堆积及大量的嗜酸性粒细胞聚集（图1B）；4周骨蚀灵胶囊组：骨小梁走形和结构改善，空骨陷窝增多，骨髓腔可见少量嗜酸性粒细胞，未见脂肪细胞增生（图1C）；4周洛伐他汀组：骨小梁走形和结构改善，空骨陷窝增多，骨髓腔可见少量脂肪细胞增生及少量嗜酸性粒细胞（图1D）。

表2 4周时各组兔血清TC、TG、HDL、LDL水平比较Tab.2 The levels of TC，TG，HDL，LDL in each group at 4 weeks（n=12） x ± s，mmol/L

图1 第4周时各组股骨头HE染色结果（×200）Fig.1 Results of HE staining of the femoral heads in the each group at fourth weeks（× 200）

2.3 MRI检查结果 对照组：T1加权（T1WI）、T2加权（T2WI）模式显示双侧股骨头表面光滑，形态规则，股骨头内部无异常信号改变，双侧髋关节间隙正常（图2）。模型组：双侧股骨头骺线模糊，股骨头表面不均匀，形态欠规则，股骨头内部出现片状不规则的长T1短T2改变区域，T2WI提示双侧髋关节间隙增宽，关节腔内液体增多，双侧软组织肌肉间隙液体增多（图3）。骨蚀灵胶囊组：可见双侧股骨头头下无异常信号带，关节间隙正常，腔内及周围软组织积液减少（图4）。洛伐他汀组：双侧股骨头骺线稍模糊，头下无异常信号改变，关节间隙正常，腔内及周围软组织积液减少（图5）。

图2 对照组兔子双侧股骨头核磁共振成像Fig.2 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the control group

3 讨论

图3 模型组兔子双侧股骨头核磁共振成像Fig.3 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the model group

图4 骨蚀灵组兔子双侧股骨头核磁共振成像Fig.4 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the Gushiling Capsule group

SANFH后期造成的骨关节炎症会对患者造成严重后果，甚至会导致患者丧失劳动能力，因此早期诊断股骨头坏死并提前预防显得非常重要［7］。临床上股骨头缺血坏死患者的早期发现主要靠核磁共振检测［8］，但股骨头内部的病理改变包括骨小梁纤细断裂和脂肪细胞增生堆积等骨坏死变化早在MRI检测出SANFH信号改变前就已经出现［9］，所以往往会降低早期的防治效果，影响患者的生存质量。大量研究表明激素是导致股骨头坏死的主要原因［10-11］，而其主要是通过扰乱机体正常的脂质代谢而导致股骨头缺血坏死［12-13］。激素可导致机体出现高脂血症［14-15］，长期使用激素可以抑制肝脂肪酶的活性并导致机体内脂肪分解大于脂肪合成，造成大量的脂肪分解产物释放进入血液循环，从而导致血清脂质水平增高，主要表现为TC、TG以及LDL升高以及HDL降低，使血液黏稠度增加，容易在股骨头微循环中形成栓子，引起股骨头微循环栓塞，造成其供血区域的股骨头缺血坏死［16-19］。同时，骨髓基质细胞在激素的作用下向脂肪细胞分化增多，脂肪堆积等病理改变，是激素诱导股骨头发生坏死的重要病理基础［20］，而骨髓腔内的空间有限，脂肪堆积将引起骨内压持续增高，股骨头内的微小血管受到压迫，加剧股骨头缺血，引起股骨头缺血坏死。临床上发现他汀类降脂药物可通过降低体内血清脂质水平有效预防激素诱导的股骨头坏死亦证明这一观点［21］。因此，在器官移植，治疗系统性红斑狼疮，风湿性关节炎，肌无力等需要长期或过量使用糖皮质激素时［10，22-23］，尽早给予药物干预，改善机体的脂质紊乱，防止股骨头组织进一步的病理改变，才可以达到预防股骨头坏死的目的。

图5 洛伐他汀组兔子双侧股骨头核磁共振成像Fig.5 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the lovastatin group

国外学者研究发现，SANFH患者体内的TC、LDL水平均显著高于正常水平，用Logistic多因素回归分析显示，TC和LDL是导致股骨头坏死的独立危险因素［15，24］。本实验病理切片观察到4周时模型组股骨头组织中出现骨小梁纤细、断裂、排列紊乱，骨髓腔内出现大量的脂肪滴堆积，在脂肪空泡间可发现丰富的嗜酸性粒细胞浸润等股骨头坏死病理改变。中医学认为，本病多因患者素体肾气亏虚，复由服用激素而发。病机关键为瘀血阻滞，筋骨失养，髓海瘀滞。因而其治则为活血化瘀、通络，行气止痛。近年来越来越多的学者通过发掘中医药的巨大宝藏，就中医药治疗SANFH的相关方面进行了许多研究［12］，目前临床将其分为气滞血瘀型、风寒湿痹型、痰湿型、气血虚弱型、肝肾不足型。而中药复方骨蚀灵胶囊由丹参、白芍桃仁、红花、川芎、土鳖虫、自然铜、乳香、没药、香附、木香、牛膝等组成，具有益气活血、补肾壮骨之功效，主要用于治疗气滞血瘀型SANFH。方以丹参、白芍为君，其中丹参活血调经，凉血消痈，安神；白芍养血调经，敛阴，缓急止痛，二药共奏活血化瘀，敛阴止痛之功效，有研究发现，丹参素可通过降低TC含量，抑制LDL水平，及时清扫多余的胆固醇，有效调节高脂血症大鼠血脂水平［25］。诸药相辅相成，以活血化瘀，通络行气，敛阴止痛为主，兼以补肝肾，续筋接骨。正合中医骨伤科“瘀祛”、“新生”、“骨合”的理论。本实验通过检测各组动物模型第2周时的血清脂质水平，发现激素均可导致TC、TG、LDL血清水平显著升高（P＜0.01），且HDL水平显著降低（P＜0.01）。第4周时，骨蚀灵胶囊组及洛伐他汀组与模型组相比，可显著降低血清TC、TG、LDL水平。同期的动物模型的核磁检测结果提示：模型组的股骨头形态出现异常，头下出现异常的信号改变带，双侧髋关节间隙增宽，及关节腔内液体增多，双侧软组织肌肉间隙液体明显增多。骨蚀灵胶囊组和洛伐他汀组的病理切片显示其股骨头内部的骨小梁的结构和脂肪细胞增生肥大等组织病理情况均比模型组要改善，同期的核磁检测结果呈相应改变，且骨蚀灵胶囊组的股骨头组织病变程度最轻，考虑为骨蚀灵胶囊的改善股骨头坏死作用和血脂调节能力优于洛伐他汀，具体原因有待进一步研究发现。

本实验选取了血清脂质中TC、TG、HDL和LDL 4个脂质检测指标研究骨蚀灵胶囊治疗SAN⁃FH的作用，实验结果表明上述4个血清脂质指标早期均出现代谢紊乱状态，中药骨蚀灵胶囊及西药洛伐他汀可通过改善早期激素诱导的血清脂质代谢紊乱，从而达到防治股骨头坏死的作用，且中药复方由于整合作用强及多靶点、毒副作用小更具有优势。本次实验仅选取SANFH复杂的脂质代谢环节中的几种脂质检测指标，检测靶点有待进一步拓展，其深入的分子机制将是下一步的研究重点。