非小细胞肺癌EGFR基因突变与EML4⁃ALK融合基因的表达及其临床病理特征

吴菡 孙苏安 刘海燕 刘文杰 黄建

南京医科大学附属淮安第一医院病理科（江苏淮安223300）

精准医疗是目前医学界的研究热点，检测相关位点突变是实施分子靶向治疗的关键，可为临床治疗方案的制定和药物改进提供重要的信息［1］。非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%～85%，其在基因组层面的多样性和复杂性决定了治疗和预防的难度较大，但也为肺癌分子靶向治疗的研究提供了更多的方向和可能［2］。表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）信号通路在肺癌分子靶向治疗中研究得较为集中且深入，而酪氨酸酶氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）则是根据EGFR异常表达调控而研制出的相应的小分子药物，并在临床上收获了显著的治疗效果［3］。RUSSO等［4］研究表明，EGFR⁃TKIs较放化疗能显著延长NSCLC患者的无进展生存期，且不良反应较少，但仍存在次级突变（secondary mutation）以及耐药性等问题，靶向药物还要根据基因研究的结果不断改进。

棘皮动物微管相关蛋白4⁃间变性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule⁃associated protein⁃like 4⁃anaplastic lymphoma kinase，EML4⁃ALK）融合基因被称为驱动程序突变，直接影响肺癌的发生和发展，是继EGFR之后的又一个研究热点［5］。CHRIS⁃TOPOULOS等［6］报道EML4⁃ALK融合基因阳性表达比例较小，但仍是重要的癌症驱动基因，临床上也针对存在ALK阳性的局部晚期和转移的NSCLC群体而研制出有效的抗肿瘤药物克唑替尼，但EML4⁃ALK融合基因突变尚不能作为评价NSCLC预后的独立因素。EGFR基因突变是肺癌靶向治疗的研究热点，EML4⁃ALK融合基因为筛选靶向药物获益人群提供依据，本研究检测NSCLC患者EGFR基因突变与EML4⁃ALK融合基因表达情况，可为完善肺癌治疗靶向分子突变类型提供更多的循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年1月至2017年6月南京医科大学附属淮安第一医院NSCLC标本213例，其中男119例，女94例；年龄25～87岁，中位年龄57岁；腺癌94例，非腺癌119例。患者均未接受过放疗、化疗、免疫治疗、EGFR⁃TKIs或ALK酪氨酸激酶抑制剂治疗。本研究患者及其家属知晓，获本院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 安捷伦Mx3000P实时荧光定量PCR仪（美国），样本提取及EGFR、EML4⁃ALK检测试剂盒购自厦门艾德生物医药有限公司。

1.2.1 核酸提取 （1）确保组织切片中肿瘤细胞比例＞50%。（2）选取肿瘤细胞富集区，8 μm切片10张至1.5 mL EP管中，加入二甲苯1 mL，振荡混匀10 s，14 000 r/min离心2 min，去上清，吸干EP管底部液体，重复上述步骤1次；加入1 mL无水乙醇，振荡混匀10 s，14 000 r/min离心2 min，去上清，吸干EP管底部液体，重复上述1次；待乙醇充分挥发后，应用AmoyDx®FFPE样品分离试剂盒（离心柱型）提取DNA和RNA。

1.2.2 EGFR突变检测 采用ARMS检测EGFR基因突变状态。样品准备：紫外分光光度仪检测提取的DNA样本浓度与质量。DNA浓度稀释至2 ng/μL，将 23.5 μL 已稀释 DNA 样品加入 1.5 μL Taq酶中混匀，依次取5 μL加入8连管PCR反应体系中。设立阴性、阳性对照，安捷伦Mx3000P实时荧光定量PCR仪检测。循环条件为95℃、5 min为1个循环；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s共15个循环；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s共31个循环。判读两种突变类型的阳性范围Ct值。

1.2.3 EML4⁃ALK融合基因检测 采用RT⁃PCR分析EML4⁃ALK融合基因突变情况。（1）RT反应体系：逆转录酶 0.5 μL、RNA 模板 6 μL（RNA 总量0.5～5.0 μg），42 ℃、1 h，95 ℃、5 min逆转录得到ALK cDNA。（2）PCR扩增：ALK cDNA加入1.5 μL混合酶混匀，依次移取5 μL加入8连管PCR反应体系中，设立阴性、阳性对照，检测仪器及循环条件同EGFR突变检测，同样判读Ct值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计数资料采用（n）或（%）表示，行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因、EML4⁃ALK融合基因突变与临床病理特征的关系 在213例NSCLC患者中，EGFR基因突变率为25.35%，EML4⁃ALK融合基因表达率为2.82%。临床病理特征方面，两种基因突变均表现为女性高于男性、非吸烟者高于吸烟者、腺癌高于非腺癌、＜60岁高于≥60岁（仅EML4⁃ALK），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 EGFR基因突变、EML4⁃ALK融合基因表达与临床病理特征的关系Tab.1 Correlation between EGFR gene mutation，EML4⁃ALK fusion gene expression and clinicopathological characteristics

2.2 EGFR基因突变和EML4⁃ALK融合基因表达的特点 54例EGFR基因突变类型为19 del（n=26）和 L858R（n=20），双重突变者共 4例。6例EML4⁃ALK融合基因突变类型均为EML4 exon13⁃ALK exon20（E13⁃A20）型V1突变。见表2。未发现同时存在EGFR、EML4⁃ALK阳性的病例。

表2 EGFR基因突变和EML4⁃ALK融合基因表达的特点Tab.2 Characteristics of EGFR gene mutation and EML4⁃ALK fusion gene

3 讨论

分子靶向治疗是肿瘤治疗的未来，有研究［7］显示，EFGR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18～21号外显子，其中19和21号外显子突变约占所有突变的90%，且在不吸烟者、女性、腺癌患者中的突变率较高，并具有一定的地域差异，如东亚人群的EGFR突变率要明显高于其他地域。仇秦威等［8］研究中国华南地区172例非小细胞肺癌患者的EFGR突变情况，结果显示EGFR突变率为32%（55/172），且热点突变为19号外显子缺失和21号外显子L858R突变；同时，发生EGFR突变也是在女性、无吸烟史和腺癌患者中比例较高。本研究中EGFR基因突变率为25.35%，其中以19号外显子E19del和21号外显子L858R突变为主（48.15%、37.03%），且仍以女性、非吸烟者和腺癌患者发生风险更高，与上述研究结果相符。目前，EFGR突变率在女性、非吸烟、腺癌中较高的原因尚不明确，LEVY等［9］研究发现，EGFR基因突变率在黄种人群要高于白种人群和黑种人群，在肿瘤组织学分级Ⅰ～Ⅱ级中也较高。YU等［10］研究表明，与miR⁃155、miR⁃16及miR⁃133a比较，非吸烟女性肺腺癌（lung adenocarcinoma，ADC）组织中miR⁃25在EGFR野生型的患者中表达升高，可能提示患者预后不佳。王玉等［11］研究发现EGFR突变患者miR⁃93⁃3p表达升高，miR⁃93⁃3p可能成为女性非吸烟肺腺癌靶向治疗的新靶点。上述研究结果提示，遗传因素、环境地域差异、生活习惯等均与EGFR突变有关，仍需进一步的研究。

EML4⁃ALK融合基因是NSCLC的一个潜在治疗靶点，是在2007年由SODA等［12］首次从NSCLC肿瘤组织中扩增出的，并已研制出ALK抑制剂——克唑替尼。目前，EML4⁃ALK突变率在NSCLC患者中并不高，LIU等［13］、ULIVI等［14］、张海燕等［15］报道的EML4⁃ALK突变率分别为8.7%（2/23）、8.4%（32/380）、7.6%（5/66），且均表现为女性、非吸烟、腺癌、年龄轻（≤59岁）具有更高的突变风险。本研究EML4⁃ALK融合基因表达率为2.82%（6/213），较上述研究结果低，考虑与本研究纳入的213例患者中女性例数较少有关（94vs.119），但在检出的6例阳性患者中，仍表现为女性、非吸烟、腺癌、年龄轻（＜60岁）的突变特点，其原因可能为亚裔女性吸烟率较低、样本量较少、纳入标准及遗传因素有关。FALLET等［16］认为EML4⁃ALK融合基因突变更倾向于淋巴结转移的中晚期病例，本研究EML4⁃ALK融合基因突变与临床分期无相关性，考虑为EML4⁃ALK融合基因突变样本数量少、病理分期分布不均有关。

本研究6例EML4⁃ALK融合基因突变类型均为 V1突变（E13⁃A20），而郑剑滔等［17］分析 9例EML4⁃ALK突变类型发现，其中双位点突变3例，具体为亚型1突变9例，亚型3突变1例，亚型2突变2例，说明亚型1是EML4⁃ALK融合基因最常见的突变类型。同时，其研究还发现了EML4⁃ALK突变（亚型1及亚型2突变）与EGFR突变（19号外显子突变）并存的病例。王旭洲等［18］也发现了6例EML4⁃ALK与EGFR两种驱动基因的同时突变，并经AMRS法和FISH法验证成立，说明EML4⁃ALK融合基因与EGFR双突变并非完全排斥，只是这种情况的发生概率较低。本研究未发现上述两种驱动基因突变的并存病例，考虑与样本量较少、检测方法较单一有关。

不足的是，首先，本研究并未对KRAS基因突变进行检测，而其突变会导致EGFR信号通路持续激活，加速肿瘤细胞增殖，影响EGFR⁃TKIs疗效［19］；其次，本研究其他EGFR突变基因也有重要的研究价值，如20号外显子T790M突变已被证实［20］是一种获得性耐药性的基因突变，其可导致第1、2代EGFR⁃TKIs药物疗效较差，同时也是第3代药物要克服的问题；再次，本研究设计也较为简单，纳入样本量较少，对于EML4⁃ALK融合基因的检测方法也较为简单，因此可在研究对象筛选、检测指标选择及检测方法应用等方面展开研究；最后，EGFR基因突变的异质性也会影响EGFR⁃TKIs疗效，如李志阳等［21］证实女性EGFR基因突变异质性率显著高于男性，而多发肺结节患者的肿瘤异质性发生率最高，这对抗肿瘤治疗具有很重要的意义，值得深入研究。

综上所述，本研究证明NSCLC患者中EGFR基因突变最为常见，EML4⁃ALK融合基因阳性表达较少，两种基因均在女性、非吸烟和腺癌患者中表达较高。本研究虽未观察到EML4⁃ALK融合基因伴EGFR基因突变的病例，但报告确有存在，而多靶点抑制剂能否使靶向治疗人群获益更大仍有待进一步研究。