溃结宁膏穴位敷贴对实验性溃疡性结肠炎大鼠IL-6/JAK2/STAT3信号通路的影响*

毛 婧朱 莹 周 瑾陈 凯陈 程

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙410005）

溃疡性结肠炎（UC）是一种发生在直肠和结肠的发病机制尚不明确的慢性非特异性炎症性疾病。目前关于细胞信号通路介导和调节UC肠道免疫应答已被广泛研究，白细胞介素-6（IL-6）/信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号通路在其中起着重要调控作用[1-3]，而该信号通路激活所引发的辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞Treg（Th17/Treg）失衡是介导肠道免疫功能紊乱的核心环节[4]。现代医学治疗UC以柳氮磺胺吡啶等药物为主，副作用大，容易复发。本文通信作者朱莹教授运用自制溃结宁膏穴位敷贴治疗本病，在患者依从性好，操作简单的优势下，临床疗效肯定。本实验基于前期实验基础，观察溃结宁膏对脾肾阳虚型UC大鼠模型的疗效，检测结肠 IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表达，进而探讨溃结宁膏治疗UC的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠52只，体质量180～200 g，购自湖南中医药大学实验动物中心，合格证号：43006700010784。

1.2 药物与试剂 噁唑酮，5 g/瓶，美国Sigma。腺嘌呤，1 g/瓶，美国Sigma。10%水合氯醛，上海展云有限公司。 多聚甲醛溶液，Biosharp。 一抗（IL-6、gp130、JAK2、STAT3），Bioss。二抗（山羊抗兔鼠通用），Biosswamp。柳氮磺吡啶（SASP），0.25 g/片，上海三维制药公司，研细过筛后配成混悬液。番泻叶，购自湖南中医药大学第二附属医院门诊药房，经中药房煎煮后浓缩为0.87 g/mL药液，保存于4℃冰箱。溃结宁膏，药物组成：炮附子、细辛、延胡索、赤芍、丁香、白芥子、生姜；无药物的巴布剂基质，药物组成：聚丙烯酸钠、明胶、高岭土、甘羟铝、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇，均由湖南中医药大学第二附属医院药剂科制成直径0.4 cm，厚0.25 cm药饼。

1.3 实验仪器 电泳仪，BIO-RAD （mini protean 3 cell）。酶标仪，芬兰雷勃（MK3）。全自动化学发光分析仪，上海天能（Tanon-5200）。UPT优普特实验室超纯水器，法国MilliPORE（ULUPURE优普）。冰箱，中国Haier（BCD-196TMZL）。 离心机，德国 Eppendorf（Centrifuge 5424 R）。

1.4 分组与造模 将大鼠随机分为空白组、模型组、敷贴组、SASP组。参考文献[5-6]，空白组予生理盐水灌胃（10 mL/kg）、灌肠（0.45 mL）。 模型组、敷贴组、SASP组第 1、2周每日予腺嘌呤灌胃（10 mL/kg）；第 3、4周每日予冰番泻叶药汁灌胃（10 mL/kg），配合冰水湿润皮毛、电风扇吹干处置；第29日大鼠背部用剃毛器脱毛2 cm×2 cm裸露皮肤，并予5%噁唑酮（无水乙醇配）0.3 mL皮肤致敏；第33、35日腹腔麻醉后行灌肠，灌肠溶液予5%噁唑酮（50%乙醇配）0.45 mL。造模结束4 d后抽取2只大鼠行结肠病理学检查，结果示所抽取2只大鼠结肠黏膜有溃疡，溃疡深至肌层，伴炎症反应，提示UC造模理想。参考文献[7]拟定脾肾阳虚UC模型大鼠宏观诊断标准：1）便溏，黏液脓血便；2）畏寒喜暖，蜷缩聚堆；3）食欲不振，毛发枯槁或脱落；4）口唇或爪尾紫暗；5）精神萎靡，倦怠，弓背；6）嗜睡，乏力，活动减少。具备前3项即可认为符合标准。将不符合标准的5只大鼠予以排除。

1.5 干预方法 造模成功后1周开始给药干预，空白组、模型组每日以生理盐水灌胃（10 mL/kg）、无药物的巴布剂基质穴位敷贴；敷贴组以生理盐水灌胃（10 mL/kg）、溃结宁膏穴位敷贴。SASP组以SASP（50 mg/kg）灌胃、无药物的巴布剂基质穴位敷贴。以上各组穴位选气海、中脘、天枢、足三里，每次1.5 h，足三里、天枢每次贴一侧，左右交替[8]。连续给药28 d后予10%水合氯醛（0.2 mL/100 g）麻醉大鼠取材。

1.6 标本采集与检测 1）一般临床观察。实验期间每天观察大鼠体质量、饮食饮水、大便次数、性质、有无血便及精神、活动、拱背、懒动、毛发光泽度等一般状况。2）疾病活动指数（DAI）评分。实验期间监测大鼠体质量、大便性状、血便情况[9]。 3）病理形态学观察。 组织病理制片：取一块病变结肠组织约1 cm，10%甲醛溶液固定，组织脱水，常规石蜡包埋，切片（4 mm），HE染色，中性树脂胶封片，显微镜下观察组织学变化。4）Western blot检测大鼠结肠黏膜中 IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表达。将结肠组织剪碎，按每20 mg组织加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃12000×g离心15 min，取上清，用BCA蛋白浓度检测法进行蛋白质定量。每孔上样量为10 μg蛋白，加入上样缓冲液后沸水浴10 min使蛋白变性后离心取上清上样，将配制好的聚丙烯酰胺凝胶放入电泳槽中，电泳完毕后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，将膜置于Blocking Buffer封闭液中封闭2 h。 然后加入一抗 （IL-6、gp130、JAK2、STAT3）4 ℃过夜，Phosphate Buffer Saline（PBS）洗涤 3次，每次5 min，再加入二抗4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5min。将膜放置在暗室中，根据用量取Electro-Chemi-Luminescence（ECL）发光液 A和 B等量混匀，加在膜的正面与之充分接触，然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，检验各组数据正态性及方差齐性，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性时用LSD法，方差不齐时用Tamhane′s法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 给药前除空白组外其余3组相继出现嗜睡懒动、毛发稀疏、爪甲暗紫、体质量下降、大便变稀、肛周污秽。给药后3组症状有不同程度改善，以敷贴组和SASP组明显：大鼠精神状态转佳，大便转成形，肛周变清洁，毛发转光泽，聚堆拱背减少，饮食饮水增加，体质量增长；模型组体质量无明显增长，仍嗜睡、懒动、毛发无光泽。

2.2 各组治疗前后DAI评分比较 见表1。与模型组相比，敷贴组、SASP组治疗后DAI评分显著降低（P＜0.01）。

表1 各组治疗前后DAI评分比较（分，±s）

表1 各组治疗前后DAI评分比较（分，±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。 下同

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2.3 各组病理形态学观察比较 见图1。空白组：大鼠结肠黏膜、黏膜下层、肌层均未见异常，腺体结构清晰，无炎性细胞浸润。模型组：结肠黏膜缺损，溃疡破坏黏膜层、黏膜下层，甚至肌层，腺体紊乱，伴大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。敷贴组：病变明显减轻，溃疡变浅变小，腺体排列尚规则，肉芽组织增生，伴少量炎性细胞浸润。SASP组：黏膜上皮基本完整，溃疡面愈合，腺体增生，肉芽组织增生，炎性细胞浸润减少。

图1 各组大鼠结肠组织形态学（HE染色，100倍）

2.4 各组大鼠结肠组织 IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表达比较 见表2、图2。与空白组相比，模型组、敷贴组及 SASP组大鼠结肠组织 IL-6、gp130、JAK2、STAT3表达显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，敷贴组与 SASP组 IL-6、gp130、JAK2、STAT3表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。敷贴组与SASP组比较，其大鼠结肠组织IL-6、gp130、JAK2、STAT3表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠结肠组织IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠结肠组织IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表达比较（±s）

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图2 大鼠结肠黏膜IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白条带

3 讨 论

结合临床表现，UC属于中医之 “肠癖”“泄泻”，据统计，UC中医证候类型以脾肾阳虚、湿热、肝郁脾虚最为常见[10]，导师朱莹教授认为，本病以慢性持续发作为特点，患者多可表现为脾肾阳虚为本，瘀血积滞为标的虚实夹杂证型。朱莹教授结合多年经验，应用溃结宁膏治疗UC，膏中炮附子、细辛、丁香温脾肾而散寒凝，延胡索、赤芍散瘀止痛，白芥子、生姜增强药物透皮性。多药配伍，共奏温肾暖脾、活血化瘀之功效。

研究发现，UC患者血清中IL-6含量明显增高，并与病变严重程度、病变范围及炎症等级呈正相关[11]。IL-6是一种多效性细胞因子，与靶细胞上特异性受体结合从而发挥多种生物学效应。研究表明，早期免疫反应时激活经典的IL-6信号转导通路：IL-6首先与靶细胞膜上IL-6R，该复合物与gp130相关联后，促使其二聚化并启动胞内信号转导[12-13]。其中活化Janus激酶（JAK2），从而激活下游效应分子信号转导和转录激活因子3（STAT3），STAT3经磷酸活化后入核，调控下游靶基因转录，参与炎症调节[14]。在DSS大鼠UC模型中，IL-6和STAT3表达增高，其表达随病变程度的增高而增高[15]。课题组前期研究脾肾阳虚型UC大鼠模型[16]，发现溃结宁膏穴位敷贴能够上调抗炎因子IL-4、IL-10并下调促炎因子干扰素-γ[17]，提示溃结宁膏治疗UC可能与调节辅助性T细胞1/辅助性T细胞2平衡相关。而IL-6/STAT3信号通路激活所引发的辅助性T淋巴细胞失衡是介导肠道免疫功能紊乱的核心环节。为揭示IL-6下游级联反应，本实验观察大鼠结肠组织 IL-6、gp130、JAK2、STAT3 蛋白的表达。

本实验结果显示，模型组大鼠一般状态、疾病活动指数评分、病理学形态好转不明显，结肠组织IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表达明显增高，提示模型组大鼠结肠组织炎症失调，IL-6/JAK2/STAT3信号通路高表达。敷贴组及SASP组大鼠一般表现、病理学形态较模型组好转，IL-6、gp130、JAK2、STAT3 蛋白水平降低，表明溃结宁膏穴位敷贴对UC的治疗可能通过抑制或阻断IL-6/JAK2/STAT3信号通路发挥作用。