鱼腥草、地龙、桑白皮提取物对肺炎支原体感染小鼠模型IL-6和IFN-γ表达的影响*

岑凯莹 王海颖

（上海中医药大学，上海 200120）

肺炎支原体肺炎（MPP）是由肺炎支原体（MP）引起的，病理改变多以间质性肺炎为主，并且可导致血液、神经、消化、泌尿、循环等多系统及皮肤的病变[1]。目前认为主要机制是机体对肺炎支原体感染产生过度的免疫应答，包括细胞因子的生产过剩和免疫细胞的激活[2-3]。白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）作为免疫与炎症重要的调节因子引起过度的免疫炎症反应，参与 MPP 的发病过程[4]。小复方（组成：鱼腥草 15 g，地龙9 g，桑白皮9 g）是上海中医药大学附属龙华医院姜拥红教授治疗小儿支原体肺炎常用方，具有良好的临床疗效，本课题组前期药敏试验发现此3味药醇提物及水提物都具有抑制支原体体外生长的作用，且地龙组、鱼腥草地龙合用组、复方组体外抑菌作用最强，然而其不同配伍方式以及不同提取物对抗MP感染的作用差异尚不明确，本实验通过研究地龙单味中药、地龙鱼腥草配伍，3药联用对MP感染小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表达影响，及对肺组织病理变化的影响，探讨其MP可能的作用机制，为进一步研究及临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级4周龄BALB/c小鼠 （批号：0307646）80只，雌雄各半，体质量 17～20 g，购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2 试药与仪器 1）试药。MP标准菌株 （ATCC-15531，美国ATCC公司）。鱼腥草、地龙、桑白皮饮片（批号：160625，160711，160308，上海康桥中药饮片公司），阿奇霉素片（国药准字H10960167，希舒美），支原体肉汤基础培养基、支原体添加剂（批号：CM0403B，SR0059C英国OXOID），MP核酸检测试剂 （#DA-D064达安基因），小鼠白介素-6（IL-6）检测试剂盒、小鼠干扰素-γ（IFN-γ）检测试剂盒（批号 xy-E11921，xyA049Mu，上海信裕生物科技有限公司），其他试剂均为国产或进口的分析纯试剂。2）实验仪器。旋转蒸发仪（RE-52AA上海亚荣生化仪器厂），ASC电子称（ASC-6上海东南衡器有限公司），电子调温电热套（98-I-B天津市泰斯特仪器有限公司），生物安全柜（BSC-1000IIA2苏净集团），低温离心机 （2-16PK Sigma公司），酶标仪（Synergy HT BIOTEK），石蜡切片机（SQ2125 徕克公司），摊片机（PPTHK-21B 徕克公司），正置显微镜（CX41OLYMPUS）。

1.3 中药提取物制备及MP培养 1）药物制备。取单味药、鱼腥草∶地龙（5∶3）、鱼腥草∶地龙∶桑白皮（5∶3∶3）混合，用打粉机粉碎，采用水煎法进行中药水提，所得药液用旋转蒸发仪低温浓缩，然后干燥脱水，即得中药水提物。药液过滤后药渣加70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并滤液后用纱布过滤，用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，所得浓缩液干燥脱水，即得中药醇提物。2）MP培养。将MP接种在支原体肉汤培养基中，置于37℃，5%CO2培养5～6 d，至培养基着色变黄并呈均匀一致的混浊时，收获处于对数期生长的人MP菌液，收获的菌液取少量传代观察，CCU法定量，调整菌液浓度至1×107ccu/mL，-80℃冷冻保存备用。

1.4 造模与分组 选取80只BALB/C小鼠随机分为造模组72只，正常组8只。造模组小鼠经乙醚麻醉后，鼻内接种 30 μL 1×107ccu/L MP 菌液，每天 1 次，共3 d，建立MP感染模型，正常组小鼠给予等量PBS。观察小鼠体征表现，造模3 d后，随机挑选8只造模组小鼠，摘眼球取血，2500 r/min，4℃离心 10 min，吸取上清，参照MP核酸检测试剂盒说明书严格操作进行支原体检测，结果显阳性，则表明造模成功。MP感染模型成功后，将造模组小鼠随机分为模型组、阿奇霉素组、地龙水提组、地龙醇提组、鱼腥草+地龙水提组、鱼腥草+地龙醇提物组、小复方水提物组、小复方醇提物组，每组8只。

1.5 干预方法 各给药组给予相应提取物混悬液，依临床给药剂量换算为小鼠等效剂量，地龙水提组、地龙醇提物组为 1.5 g/（kg·d）；鱼腥草地龙水提组、鱼腥草地龙醇提组为4 g/（kg·d）；小复方水提组、小复方醇提组为 5.5 g/（kg·d），阿奇霉素组为 41.67 mg/（kg·d），给药容积0.1 mL/10 g体质量，连续给药7 d。正常组和模型组小鼠给予等量生理盐水，各组小鼠均正常喂养，自由饮水。

1.6 标本采集与检测 1）小鼠每日称体质量、记录精神状态及体质量变化。2）末次给药后，摘眼球取血，4℃，2500 r/min离心10 min，取上层血清-80℃冻存备用。取小鼠肺组织，左肺用4%多聚甲醛固定，用于HE染色，右肺液氮冻存，转移-80℃冰箱中保存，用于进一步实验研究。2）肺湿质量：称取小鼠的肺组织，计算肺湿重指数[（肺质量/体质量）×100%]。 3）白介素-8（IL-8）和IFN-γ：取各组小鼠血清，参照ELISA试剂盒说明书严格操作，检测血清中IL-6和IFN-γ的含量。4）肺组织病理学观察：取小鼠肺组织，置于10%甲醛中固定48 h，流水洗涤组织，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片，切片厚度为4～7 μm。65℃烤片、二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度乙醇水化，苏木素-伊红染色，二甲苯透明和封片，通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析检验方法，等级资料非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般情况 实验结束时，正常组小鼠状况良好，活泼爱动，反应灵敏。模型组小鼠有寒战，精神萎靡，食欲减退，体质量下降等表现。各治疗组小鼠相较于模型组症状有所减轻。

2.2 各组小鼠体质量、肺质量、肺湿质量指数比较见表1。与正常组相比，模型组小鼠体质量及肺质量显著下降（P＜0.05），肺湿质量指数显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，各给药组体质量显著上升（P＜0.05），给药7 d后，各给药组小鼠肺湿质量指数均有不同程度的下降，其中阿奇霉素组、鱼腥草+地龙水提物组、鱼腥草+地龙醇提物组、小复方水提物组、小复方醇提物组小鼠肺湿质量指数显著降低（P＜0.05）。

2.3 各组肺组织病理学观察 见表2，图1。从HE染色的结果可以看出，正常组肺泡结构均匀清晰，肺泡内无渗出，偶见淋巴细胞和巨噬细胞浸润在支气管和血管周围及肺泡间隔；模型组MP感染小鼠肺组织出现典型的间质性肺炎以及融合性支气管肺炎变化，肺泡腔狭窄、缩小。肺泡隔增厚，肺泡间质中有大量炎性细胞增生和浸润；与模型组相比，各给药组的间质性炎症反应减轻，淋巴和巨噬细胞浸润明显。其中阿奇霉素组、鱼腥草+地龙醇提物组、小复方水提组、小复方醇提组，病理症状改善更为显著。

表1 各组小鼠体质量、肺质量、肺湿质量指数比较（±s）

表1 各组小鼠体质量、肺质量、肺湿质量指数比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

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图1 各组小鼠肺组织病理改变（HE染色，200倍）

表2 各组MP感染小鼠肺组织病理变化（n）

2.4 各组小鼠血清IFN-γ、IL-6的表达水平比较 见表3。与正常组相比模型组小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表达水平较高（P＜0.05），与模型组相比各给药组小鼠血清中 IFN-γ、IL-6 的表达水平降低（P＜0.05）。

表3 各组小鼠血清IFN-γ、IL-6的表达水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组小鼠血清IFN-γ、IL-6的表达水平比较（pg/mL，±s）

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3 讨 论

MP感染临床多以上感、支气管炎、肺炎等证为表现，证属中医“肺炎喘嗽”“肺风咳嗽”范畴。外感六淫时邪、正气亏虚为本病的两大病因，临床上治疗本病多以清热解毒、燥湿化痰及止咳平喘为主。小复方中鱼腥草归肺经、膀胱、大肠经，是“肺痈”要药，具有清热解毒，化痰消痈，利尿通淋的作用。现代研究表明具有抗氧化、抑制细菌、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤和提高免疫力等功效[5]。地龙归肝、肺、肾经，具有清热止痉，平喘利尿，通络活血的功效，具有调节免疫抗菌消炎、止咳平喘等作用[6]。桑白皮入肺经、脾经，具有泻肺平喘；利水消肿的功效，现代药理学表明具有抗炎、镇咳、平喘和提高免疫力等功效[7]。鱼腥草、地龙、桑白皮均为临床治疗肺系疾病常用的药，3药联用清热解毒、止咳平喘。前期研究发现地龙水提物、地龙醇提物、鱼腥草+地龙水提物、鱼腥草+地龙醇提物、小复方水提物及醇提物体外抑制MP作用较好，本实验结合中医理论，探索小复方提取物及不同配伍方式对MP感染小鼠的作用，并研究其可能的作用机制。

迄今为止，MPP发病机制仍不十分清楚，目前主要有呼吸道上皮细胞黏附、免疫学发病机制和MP直接侵入学说，国内外大量研究证实细胞因子在MP感染的发病中起着重要作用[8-9]。IL-6是炎症急性期合成的重要介质，并参与肺部炎症的病理过程，在维持动态平衡，在机体免疫自稳、免疫防御中起着重要作用[10]。研究者发现MP感染小鼠肺泡灌洗液中IL-6水平与MP感染程度成正相关，血清中IL-6浓度可反映MPP患儿的病情轻重，IL-6在MPP的发病发展过程中起重要作用[11-12]。IFN-γ由活化T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）产生，IFN-γ具有抗病毒，激活体液免疫的作用[13]，研究表明IFN-γ水平变化有助于早期识别 RMPP[14-15]。

过度的免疫应答，包括细胞因子的生产过剩和免疫细胞的激活，是MP的主要发病机制，因此及早抑制炎症因子的表达，抑制过度免疫，是治疗MP的有效途经之一。实验研究发现模型组小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表达水平较高，而各治疗组小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表达水平均有一定程度的降低，其中复方醇提物组，鱼腥草+地龙醇提物组降低更为显著。

病理组织学观察小鼠肺脏的变化，发现模型组有大量淋巴细胞和单核细胞的浸润，各治疗组病理症状均得到一定程度的改善。实验结果表明各中药提取物均可减轻MP感染小鼠炎症程度，其中复方醇提物组优于其他提取物组，其抗MP感染的作用机制可能与下调IFN-γ和IL-6表达水平，抑制过度免疫有关，具体机制有待进一步研究。