通腑泻肺法对ALI/ARDS大鼠炎症反应的调控作用*

苏景深 刘恩顺 孙增涛 郑 莉 赵鑫民 陈善夫

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150；2.天津市津南区咸水沽医院，天津 300073；3.天津中医药大学，天津 300193）

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）属于Ⅱ型核受体超家族成员，可分为PPAR-α、PPAR-β（PPAR-δ或NUC-1）和 PPAR-γ 3种亚型，其中PPARγ除具有调节体内糖、脂肪代谢、细胞分化等作用外，在抑制炎症反应方面亦发挥重要作用，其在呼吸系统疾病的作用受到越来越多的重视[1]。 TOLL 样受体 4（TLR4）是调控内毒素（LPS）的主要受体和跨膜信号转导分子，LPS/TLR4/核因子 κB（NF-κB）信号传导途径是介导炎症反应重要的信号传导通路[2]。目前认为急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）的本质是一种炎症反应，前期研究发现，通腑泻肺中药能够降低血清细胞因子水平，减轻肺组织和全身的炎症损伤，但是其作用靶点不明确[3]。为此，笔者用LPS复制大鼠ALI/ARDS模型，观察PPARγ-TLR4/NF-κB表达的改变，探讨通腑泻肺中药的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康 SD 大鼠 27只，雄性，体质量（200±20） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXX（京）2012-0001，购入后置天津工程所实验中心常规饲养。

1.2 试药与仪器

1）试药：自拟通腑泻肺方（组成：葶苈子20 g，桑白皮 20 g，大黄 30 g，枳实 10 g，厚朴 10 g）中药免煎颗粒剂，购自天津中医药大学第二附属医院药房。生药剂量比例按照文献[4]进行换算，生药质量浓度（0.1701 g/mL）。通腑泻肺中药用蒸馏水配置，4℃冰箱保存备用。大肠杆菌内毒素脂多糖（sigma）。超纯RNA提取试剂（TaKaRa Code D9108B），反转录试剂盒（TaKaRa code DRRO47A），Real-time PCR 试 剂 盒（TaKaRa code DRR420A），5x RNA Loading Buffer（TaKaRa code DRR420A）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）ELISA试剂盒均购自上海博谷生物科技有限公司。PPARγ、NF-κB p65、TLR4 抗体均购自 Abcam 公司。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。2）仪器：去离子水仪（PALL，Purelab Plu），高速离心机（Centrifuge 5415D，Eppendorf公司）， 荧光定量 PCR 仪（ABI7500，Applied Biosystems），分光光度计（NANODROP 2000，Therno scientific），涡旋振荡仪（QL-902，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），转移脱色摇床（TS-8，海门其林贝尔仪器制造公司）。

1.3 分组与造模

动物购入后适应性饲养1周，将大鼠随机分为空白组、模型组、中药组，每组9只。参照文献[5]的造模方法将大鼠置于大鼠固定器，暴露尾部，空白组大鼠尾静脉注射生理盐水2 mL/kg；模型组与中药组尾静脉注射内毒素8 mg/kg，复制ALI/ARDS模型。

1.4 给药方法

空白组大鼠静脉注射生理盐水，每次0.01 mL/g。模型组在造模完成后灌服生理盐水，每次0.01 mL/g。中药组在造模完成后给予通腑泻肺中药灌胃，每次0.01 mL/g，每日1次。第7日各组大鼠予水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，仰卧固定。打开胸腹腔，行支气管肺泡灌洗、腹主动脉取血并取右下肺组织。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 ELISA法检测大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达 于大鼠腹主动脉取血，离心得到血清后进行ELISA检测。以bulldog血管夹夹闭左主支气管，套管针接5 mL空针注入4 mL PBS缓冲液可见右肺膨起，缓慢回抽，反复4～5次后可回收约 2～3 mL 液体。 1200 r/min、4 ℃，离心 10 min，上清，-20℃分装保存，进行ELISA检测。分别测定血清中及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表达情况，操作步骤按参照试剂盒说明书进行。

1.5.2 免疫组化染色方法检测检测肺组织PPARγ、NF-κB p65及TLR4蛋白的表达 将右下肺组织切片行脱蜡、水化处理后，高压修复抗原，用3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化酶，血清封闭后各组切片分别加入兔源性PPARγ、NF-κB p65及TLR4多克隆抗体（均为1∶100稀释），4℃过夜后加入兔二抗，经二氨基联苯胺兰（DAB）显色，光镜下观察。 PPARγ、NF-κB p65及TLR4的阳性反应产物均呈棕黄色。光学显微镜下随机观察5个视野、拍照，代表该动物肺组织蛋白表达强度。应用Image-Pro Plus6.0软件分析阳性细胞数，同时将空白对照组阳性细胞率设置为100%，计算其他组别的阳性细胞率，并对结果进行统计分析。

1.5.3 RT-PCR 检测肺 PPARγ、NF-κB p65 及 TLR4 mRNA表达 按照总RNA提取试剂盒说明书提取大鼠肺组织总RNA，紫外分光光度计测总RNA浓度。再根据反转录试剂盒说明书，以大鼠肺组织总RNA为模板，反转录合成cDNA。随后按照扩增试剂盒说明书进行 PCR 扩增。扩增程序为：95℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60℃34 s）×40个循环。根据Real-Time PCR原始检测结果，采用2-△△cta法相对定量。PCR引物碱基序列见表1。

表 1 PPARγ mRNA、NF-κB P65 mRNA、TLR4 mRNA 和Actin 引物设计（5′to 3′）

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组血清及 BALF中炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表达比较

见表2。与空白组相比较，模型组大鼠血清炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表达水平均升高（P＜0.05）。 中药组TNF-α、IL-6， 表达水平均下降 （P＜0.05）。 IL-1β、IL-10水平有下降趋势（P＞0.05）。 与空白组相比较，模型组大鼠BALF中炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表达水平均升高 （P＜0.05）。 中药组TNF-α、IL-6、IL-1β 表达水平均下降（P＜0.05），IL-10水平有下降趋势（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达比较（ng/L，±s）

表2 各组大鼠血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达比较（ng/L，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 下同

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2.2 各组肺组织PPARγ、NF-κB p65及TLR4蛋白分布与表达

见表3。PPARγ蛋白以细胞核着色为主，为深棕色，细胞浆偶见表达（图1）；NF-κB p65蛋白主要表达于细胞浆，细胞核少量表达，为棕黄色颗粒 （图2）；TLR4蛋白属于跨膜蛋白，主要表达于内皮细胞上，呈淡棕黄色（图3）。与空白组相比较，模型组大鼠肺组织中 NF-κB p65、TLR4 蛋白表达水平升高（P＜0.05），模型组大鼠肺组织中PPARγ蛋白表达水平下降 （P＜0.05）；与模型组相比较，中药组大鼠肺组织中NF-κB p65、TLR4蛋白表达显著下降趋势（P＜0.05）。与模型组相比较，中药组大鼠肺组织中PPARγ蛋白表达升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肺组织PPARγ、NF-κB p65及TLR4平均光密度值比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织PPARγ、NF-κB p65及TLR4平均光密度值比较（±s）

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图1 各组大鼠肺组织PPARγ表达（DAB染色，400倍）

图2 各组大鼠肺组织NF-κB p65表达（DAB染色，400倍）

图3 各组大鼠肺组织TLR4表达（DAB染色，400倍）

2.3 大鼠肺组织 PPARγ、NF-κB p65及 TLR4 mRNA表达比较

见表4。RT-PCR电泳结果显示模型组较空白组大鼠肺组织中NF-κB p65、TLR4 mRNA表达水平升高（P＜0.05），模型组大鼠肺组织中PPARγ mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与模型组相比较，中药组大鼠肺组织NF-κB p65、TLR4 mRNA表达水平与之相比明显下降（P＜0.05）。与模型组相比较，中药组大鼠肺组织中PPARγ mRNA表达明显升高（P＜0.05）。

表4 各组大鼠肺组织PPARγ mRNA、NF-κB p65 mRNA及TLR4 mRNA 表达比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织PPARγ mRNA、NF-κB p65 mRNA及TLR4 mRNA 表达比较（±s）

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3 讨 论

ALI/ARDS状态下，炎症介质大量产生并相互作用，形成网络，且不断循环促进，形成“瀑布样”反应[4]。近来研究发现，PPARγ在炎症反应中发挥重要作用，如溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化和心肌炎等。其对于呼吸系统疾病的作用受到越来越多的重视[5-6]，Cho 等[7]研究发现15d-PGJ2通过激活PPARγ明显减轻高氧诱导肺部炎症及水肿。Morin等[8]进一步研究发现激活PPARγ可调控p38-丝裂原活化蛋白激酶信号通路，从而在肺部急性炎症中发挥抗炎作用。Xiao等[9]发现PPARγ配体-曲格列酮通过抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞TNF-α分泌减轻其凋亡，并增加表面活性物质相关蛋白A的表达，从而对急性肺损伤起保护作用。有研究发现PPARγ抑制NF-κB介导的炎性信号以维持对于生理炎症的适当控制。然而，当LPS激活TLR4信号通路时，NF-κB驱使PPARγ降低表达从而加速炎症过程[10]。

根据ALI/ARDS临床表现的呼吸窘迫、发绀、便秘、腹满等特点，中医学从“肺与大肠相表里”这一体现脏腑相关的整体观的理论出发，将ALI/ARDS病机特点概括为肺肠同病，治疗当以通腑泻肺为法。通腑泻肺中药由大黄、枳实、厚朴、葶苈子、桑白皮组成。方中大黄、厚朴、枳实，可以轻下热结，除满消痞；葶苈子、桑白皮泻肺平喘，行水消肿。全方药简力专，既能泻肺平喘，又能通腑泻热，肺肠同治，具有改善患者临床症状，提高生活质量作用。有研究表明通腑泻肺方法治疗肺系脓毒血症在临床上取得了较好的疗效[11]。曲爱君等[12]研究证明，大黄能显著降低全身炎性反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）患者血清TNF-α水平。枳实总黄酮提取物可通过抑制COX-2、iNOS及促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的表达阻断脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7中的NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK）信号通路，最终发挥抗炎作用[13-14]。桑白皮可以干预肺热证，抑制 TNF-α、IL-1β炎症因子表达可能是其减轻小鼠肺热证肺组织损伤的主要途径[15]。

本次实验结果表明，由LPS复制大鼠ALI/ARDS模型出现炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的显著升高，NF-κB p65、TLR4蛋白及其mRNA表达升高，PPARγ蛋白及其mRNA表达下降。使用通腑泻肺中药进行干预后血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 的水平下降，NF-κB p65、TLR4 蛋白及其 mRNA表达降低，PPARγ蛋白及其mRNA表达升高。提示通腑泻肺中药可以上调ALI/ARDS状态下PPARγ的表达，调控TLR4/NF-κB信号通路，降低TLR4介导的“瀑布样”炎症反应，控制炎症反应程度。研究结论为临床治疗提供了新思路。但是由于ARDS发病过程复杂，通腑泻肺中药的作用可能为多环节、多靶点，因此需要进一步深入探索。