ELISA可视化微阵列芯片法检测蜂蜜中硝基呋喃类药物的残留量

□ 许月明 潘言方 李慧慧 芜湖职业技术学院

硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，并作为鸡肉、禽类、水产和猪的促生长添加剂使用。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可能导致实验动物发生癌变和基因突变。鉴于此，硝基呋喃类药物在1995年已经在治疗和饲料中禁用。硝基呋喃类药物在体内很快被代谢，但其代谢产物在组织中则能存留较长时间。因此管理部门在检测硝基呋喃类药物残留时通常也分析此类药物的代谢产物的含量。

ELISA可视化微阵列芯片检测系统可对单个样本中多个硝基呋喃类药物代谢产物进行同时定量检测，并配套有相关检测设备，可以使检测效率比传统实验室的分析方法如LC、LCMS、LC-MS/MS、ELISA方法等更高效，具有操作简单、检测速度快、检测样本量大、精确度和灵敏度好等特点，且自动化程度高。

1 检测原理

ELISA可视化微阵列芯片用于蜂蜜等样品中抗生素残留检测是基于间接竞争免疫分析原理。ELISA可视化微阵列芯片微孔中包含有识别多个硝基呋喃抗生素代谢物分子的人工抗原点，当在微孔反应区内加入待测抗生素样品与相应抗体后，游离的待测物和芯片上固定的人工抗原点竞争结合相应的抗体。因此游离的待测物越多，抗体与固定在芯片上的相关抗原点的结合量就越少。待反应完毕洗涤后，加入纳米催化显色试剂，纳米颗粒经催化反应而直径显著增加，在芯片表面形成肉眼可见的黑色斑点。各黑色斑点通过芯片分析仪自动扫描检测后可获得各斑点的相关灰度值。由于样品中残留的抗生素含量与样品的灰度值呈负相关，经芯片分析软件与标准曲线自动比较计算后，即可得出各相关硝基呋喃代谢物的含量，可实现多个硝基呋喃代谢物的同时定量检测。

2 实验仪器和试剂

2.1 实验仪器

芯片分析仪、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管（10mL）、天平（感量 0.1g）、容量瓶（100mL）、洗板机、恒温振荡仪、玻璃试管10mL，聚苯乙烯离心管50mL、2mL。微量移液器：单道20～200 μL，100～1000 μL，1000～5000 μL。

2.2 实验试剂

甲醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓盐酸、三水合磷酸氢二钠、去离子水，均为分析纯。

2.3 溶液的配制

2.3.1 磷酸盐缓冲液

称取22.8g三水合磷酸氢二钠，加入1 L去离子水溶解混匀。

2.3.2 1mol/L盐酸溶液

移取8.3mL浓盐酸（12mol/L，质量分数37%），加入去离子水定容至100mL，混匀。

2.3.3 1mol/L氢氧化钠溶液

称取4.0g氢氧化钠加入100mL去离子水溶解混匀。

2.3.4 洗涤工作液

用去离子水将20X浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释（一份20X浓缩洗涤液+19份去离子水）用于芯片板的洗涤，洗涤工作液在4℃（39.2℉）环境可保存一个月。

2.4 ELISA可视化微阵列芯片组成（96T）

2.4.1 微量测试孔

每条8孔，一板12条。

2.4.2 标准液6瓶

标准液0.5mL/瓶，包括AMOZ、AOZ、SEM、AHD的标准液，详细信息见表1。

2.4.3 其他溶液

抗体工作液 3mL，二抗工作液6mL，显色液A 4mL，显色液B 4mL，20X浓缩洗涤液 25mL，衍生化试剂10mL，样本复溶工作液 50mL。

3 实验内容

3.1 蜂蜜样品的前处理（稀释倍数：1倍）

称取1g蜂蜜样品至50mL聚苯乙烯离心管中，依次加入4mL去离子水，500 μL 1mol/L 盐酸溶液，100 μL 衍生化试剂；用振荡仪（2400r/m）振荡30 s；在60℃水浴下，孵育2 h（注意：此衍生反应步骤可用如下步骤代替：在37℃下，孵育14 h左右，效果相同。）

孵育完成后依次加入以下试剂：5mL磷酸盐缓冲液，400 μL 1mol/L氢氧化钠溶液，6mL乙酸乙酯；用振荡仪（2400r/m）振荡3min；在25℃4500rpm转速下离心15min；移取3mL上层乙酸乙酯至10mL干净干燥的玻璃试管中，于50℃下氮气吹干；加入1mL正己烷，用振荡仪（2000r/m） 振 荡 3min， 再 加 入 500 μL 样 本复溶工作液，用振荡仪（2000r/m）振荡3min；移入2mL聚苯乙烯离心管中，在12000r/m转速条件下离心15min；去除上层有机相，取下层水相25μL用于分析（如果很难通过正己烷层移取较低水状层，可以先取500 μL较低层后重复步骤7，然后再移取50 μL较低水状层用于实验。）

表1 标准品种类及呋喃代谢物

表2 检测项目及检测灵敏度

表3 检测项目及交叉反应率

表4 呋喃它酮代谢物AMOZ实验结果

3.2 检测步骤

（1）使用30min以上（注意：每种液体试剂使用前均须摇匀，所有试剂需避光保存）前将芯片置于室温（20～25℃）平衡。

（2）取出需要数量的芯片微孔条插入框架中，确保其水平稳固。将不用的微孔条放入自封袋密封，保存于2～8℃，不要冷冻。

（3）编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均做双孔平行。

（4）加样：依次加入25 μL样品或标准品和25 μL抗体工作液到各自的微孔中，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃ 600r/m振荡速度下反应45min。

（5）洗板：小心揭开盖膜板，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μL/孔 洗涤反应孔，充分洗涤3次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清楚的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

（6）在每孔中加入二抗工作液50μL/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，37℃ 600r/m振荡速度下反应30min，取出重复步骤5。

（7）显色：显色液A和显色液B临用过时1∶1混合均匀（注意：过早混匀将影响结果的检测）。每孔加入混合液50 μL，37℃ 600r/m 避光显色约12min。（如若微孔内黑色沉淀较深或较浅，可适当缩短或延长反应时间，但显色时间应控制在11～13min内。）

取出重复步骤5。

表5 呋喃唑酮代谢物AOZ实验结果

表6 呋喃西林代谢物SEM实验结果

（8）测定：将显色后的芯片放入芯片分析仪中获取图像，启用默认的芯片专用软件进行自动化分析，结果报告将自动生成。

3.3 ELISA可视化微阵列芯片技术指标

3.3.1 检测项目及灵敏度（见表2）

3.3.2 交叉反应率（见表3）

表7 呋喃妥因代谢物AHD实验结果

4 实验结果

4.1 呋喃它酮代谢物AMOZ实验结果（见表4）

4.2 呋喃唑酮代谢物AOZ实验结果（见表5）

4.3 呋喃西林代谢物SEM实验结果（见表6）

4.4 呋喃妥因代谢物AHD实验结果

（见表7）

4.5 结论

蜂蜜中要求硝基呋喃类四类代谢物浓度要≤0.2μg/L，且四类代谢物浓度的和要＜0.5μg/L，所以试验所得编号为19和24不合格，其他均合格。

5 检测注意事项

向孔内移液时，移液嘴朝向芯片的前边缘，不要接触到芯片表面；所有样品和试剂的添加，洗涤和孵育都要在芯片架上完成；在洗板过程中如果出现板孔内干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的线性；应注意洗板拍干后立即进行下一步操作；不要使用超过有效日期的芯片；不要交换使用不同批号的盒中试剂；稀释试剂或掺杂使用芯片板条会引起灵敏度、信号值的变化。