复方倍他米松注射液对小鼠B16 黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响

李 敏,周明伟,刘翔宇,孙铭徽,贾玉玺*

(1.吉林大学中日联谊医院 皮肤科，吉林 长春130033；2.北京大学医学部)

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，发病率约为4%，致病因素可能与下列因素有关：黑素细胞自毁、氧化应激、自由基、免疫发病学说、细胞因子、微量元素等。研究表明，8-MOP对B16细胞有一定的增殖作用[1]，糖皮质激素是治疗白癜风的有效药物之一，酪氨酸酶是黑素合成限速酶，其活性与黑素合成呈正相关[2]。本实验采用小鼠B16黑素瘤细胞为模型，通过酶学细胞实验筛选复方倍他米松注射液对小鼠B16细胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素生成的影响，探讨其治疗白癜风的作用机制。

1 材料和方法

1.1材料

小鼠B16黑素瘤细胞株(中国科学院军事研究所提供)。胎牛血清及RPMI1640(Gibco)；二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚、L-多巴为Sigma公司产品；CCK-8试剂(东洋纺织)。复方倍他米松注射液(国药准字J20140160,进口药品注册证号、批号H201301888、 6BBKADAC03)。甲氧沙林(8-MOP)，重庆华邦制药股份有限公司生产(国药准字H50021757)。倒置生物显微镜(LaiKa公司)；全自动酶标仪(Epoch BioTek)、二氧化碳培养箱(三洋)。

1.2方法

1.2.1小鼠B16黑素瘤细胞培养[3]1640培养基传代，置于含5%CO2饱和湿度，温度为37℃培养箱中进行培养，用胰蛋白酶(体积分数0.25%)消化生长至融合状态的细胞，每3天传代1次，每瓶约105个细胞传代至25 cm2。

1.2.2细胞增殖活性测定 取100 μl消化好的对数生长期细胞液(5×104个/ML)，接种于96孔板，37℃、5% CO2条件培养24 h，设定复方倍他米松低、中、高剂量组(培养基+复方陪他米松),最终工作浓度为10、20、40 μmol/L；甲氧沙林低、中、高剂量组(培养基+甲氧沙林)，甲氧沙林最终工作浓度分别为10、50、100 μmol/L；细胞阴性对照组(培养基)。向培养板每孔加入 10 μl不同浓度的待测物质，孵育48 h，向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，孵育2 h，每组设3个复孔，置酶标仪450 nm波长测吸光度值，实验平行重复3次，取均值。

1.2.3黑素含量测定(氢氧化钠裂解法) 细胞接种方法同上，预先用不同浓度复方倍他米松注射液、甲氧沙林培养细胞72 h后弃上清液，用磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入氢氧化钠(100 μmol·L-1)，37℃水浴1 h，每组设3个复孔，置酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，用所测的吸光度值表示黑素生成量,实验平行重复3次，取均值。

1.2.4酪氨酸酶活性的测定[4]细胞接种方法同上，不同药物作用72 h后弃上清液，磷酸盐缓冲液反复冲洗2次，每孔加入100 μl体积分数1%聚乙二醇辛基苯基醚，震荡5 min ，置于-20℃1 h ，随室温融化，细胞完全裂解，每孔加入100 μl磷酸盐缓冲液配制体积分数为0.1% L-多巴液，37℃，含5% CO2培养箱孵育2 h，每组设3个复孔，酶标仪490 nm波长处测定吸光度值，用所测吸光度值表示酪氨酸酶的活性，实验平行重复3次，取均值。

2 结果

2.1小鼠B16黑素瘤细胞增殖活性测定

与对照组相比，各浓度复方倍他米松注射液及中、高浓度甲氧沙林在促进细胞增殖方面作用的差异有统计学意义(P<0.05)，各浓度复方倍他米松注射液与甲氧沙林相比，促进细胞增殖方面作用的差异有统计学意义(P<0.05)，复方倍他米松注在高浓度有显著促进细胞增殖作用，结果见表1。

表1 复方倍他米松注射液对小鼠B16黑素瘤细胞增殖活性的影响

注：与对照组比较aP<0.05,与甲氧沙林组比较bP<0.05

2.2黑素生成含量测定

与对照组相比，各浓度复方倍他米松注射液及甲氧沙林在促进细胞黑素生成作用的差异有统计学意义(P<0.05)，各浓度复方倍他米松注射液与甲氧沙林促进细胞黑素生成作用的差异有统计学意义(P<0.05)，随着复方倍他米松注射液浓度的增大黑素合成逐渐增加，结果见表2。

表2 复方倍他米松注射液对小鼠B16黑素瘤细胞黑素生成量的影响

注：与对照组比较aP<0.05,与甲氧沙林组比较bP<0.05

2.3酪氨酸酶活性测定

与对照组相比，各浓度复方倍他米松注射液及甲氧沙林在促进酪氨酸酶活性作用的差异有统计学意义(P<0.05)，中、高浓度复方倍他米松注射液与甲氧沙林相比，在促进酪氨酸酶活性作用的差异有统计学意义(P<0.05)，随着复方倍他米松注射液浓度的增大酪氨酸酶活性逐渐增加，结果见表3。

表3 复方倍他米松注射液对小鼠B16 黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响

注：与对照组比较aP<0.05,与甲氧沙林组比较bP<0.05

3 讨论

白癜风易诊断难治疗，目前治疗方案主要分为外用药物治疗，如糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂；光疗法，如NB-UVB，308准分子激光；手术治疗，如皮肤碎片移植、负压吸疱表皮移植及联合治疗，但尚无可维持长期疗效的治疗方案[5]。

本实验探讨了复方倍他米松注射液对酪氨酸酶、黑素瘤细胞增殖、黑素生成的影响，酪氨酸酶是黑素合成的关键限速酶[6]。目前，酪氨酸酶的活性成为研究白癜风等色素障碍性疾病的靶点。结果显示：对照组比较，不同浓度组复方倍他米松注射液可对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性均有明显的促进作用，其中高浓度效果明显，且各指标具有一致性。酪氨酸酶活性增加，可促进黑素合成，从而可能提高白癜风的治疗效果[2]。糖皮质激素治疗白癜风机制可能是一个双向的过程：首先，糖皮质激素可抑制免疫系统异常导致的黑素细胞损伤，从而刺激黑素细胞再生，同时可以刺激黑素细胞的生物合成进而刺激黑素细胞再生[7]。本试验为复方倍他米松注射液治疗色素脱失性疾病奠定了理论依据。