葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

朱惠君，唐玉瑾，张胜平，张朝红，李 琰

(1 西北农林科技大学a生命科学学院，b园艺学院，农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西 杨凌712100；2 南京中山制药有限公司，江苏 南京210046)

葡萄(VitisviniferaL.)果实鲜美、香味浓郁、营养丰富。据国际葡萄与葡萄酒组织 (international organisation of vine and wine，OIV) 最新统计预测，全球葡萄种植面积在2015年上升至75 340 km2，中国鲜食葡萄产量已持续多年位居世界第一。无核葡萄是鲜食葡萄的主要类型，根据授粉结实特性差异可将无核葡萄分为单性结实、假单性结实(种子败育型)和刺激性单性结实3类。单性结实品种的卵细胞不经过受精作用或其他物质刺激而直接发育形成果实，没有种子形成，其无核性状不能遗传给下一代，因此在育种中难以利用[1]，而且品种很少，生产价值极低。刺激性单性结实本身为有核品种，常用激素处理产生无核，不同年份处理后无核率有差异，而且果品安全性受到消费者质疑。假单性结实型无核葡萄可以正常进行授粉受精，但受精胚珠在发育过程中败育解体不能形成正常的种子，在果实成熟时残留大小不同的种痕[2-3]。优良的假单性结实型无核品种仅留下小而软的种子痕迹，因此人们在食用时感觉不到种子的存在。假单性结实无核葡萄胚珠的败育在不同时间、不同地点稳定性较高，主要由假单性结实型无核葡萄的基因决定。近年来，葡萄无核基因研究引起许多科研工作者的重视，且已经开展了大量研究工作[4-9]，但目前为止葡萄胚珠败育过程中的分子机理依然未被彻底揭示。

MADS-box家族成员是广泛存在于真菌、植物和动物中的一类转录因子。植物中MADS-box基因功能最早被鉴定出可调控花器官发育，但后来研究表明，MADS-box基因家族不同成员在植物生长发育的多种生命过程中发挥着非常重要的作用[10],例如果实形成[11]、离区发育[12]、分生组织决定[13]以及应答外界胁迫[14]等。植物中MADS-box基因家族被划分为类型Ⅰ和类型Ⅱ。根据系统发育分析可将类型Ⅰ中MADS-box基因分为Mα、Mβ、Mγ和Mδ型4类[15]。类型Ⅱ则包括动物和酵母中的MEF2-类基因和植物中的MIKC型基因[16]。

MIKC型基因包括MADS(M-)、intervening(I-)、keratin-like (K-)和 C-terminal (C-)结构域[17-18]，而MIKC型MADS-box基因根据I结构域的结构差异又可分为MIKCC和MIKC*2个亚类[19]。MIKCC类基因最早在金鱼草和拟南芥中作为花器官特征决定基因被鉴定出来。按照它们在花器官发生过程中的功能可将其分为A、B、C、D和E 5类，这5类基因经过不同组合可以特异地决定花萼片(A + E)、花瓣(A + B + E)、雄蕊(B + C + E)、心皮(C + E) 和胚珠(D + E)的发育。关于MADS-box基因参与胚珠和种子发育的研究有很多[20-28]，其中SEP基因影响胚珠发育的相关报道较多，而SEP基因是MIKCC亚类中E类成员之一。Favaro等[29]对SEP基因突变体的研究显示，突变体后代部分胚珠会转化为叶片状和心皮状结构，说明SEP基因是正常胚珠发育所必需的。

本研究以本课题组构建的‘无核白’葡萄胚败育过程中的胚珠全长cDNA(complementary DNA)文库为材料，克隆得到VviSEP2基因，同时采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术，分别对VviSEP2基因在葡萄各组织器官及无核葡萄品种‘无核白’和有核葡萄品种‘黑比诺’胚珠发育不同时期的表达模式进行了分析，以此来探究VviSEP2基因与葡萄胚败育之间的关系，为无核葡萄胚珠败育研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用‘无核白’葡萄胚败育过程中的胚珠全长cDNA文库库液,保存于农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室;假单性结实型无核葡萄品种‘无核白’(Vitisviniferacv.Thompson Seedless)和有核品种‘黑比诺’(Vitisviniferacv.Pinot Noir),均来自于西北农林科技大学园艺学院种质资源圃。于‘无核白’和‘黑比诺’葡萄初花期时，将花穗穗尖及已经盛开的花蕾除去，随后用纸袋将整个花穗套袋，3 d后解开纸袋并将未盛开的花蕾除去，以达到使整个花穗花期基本保持一致的目的。自花后10 d开始，每隔5 d分别采集‘无核白’和‘黑比诺’葡萄的果穗，直至花后45 d结束。将采集到的果穗置于冰上剥离出胚珠后装入2 mL离心管内，随后立即液氮冷冻并保存于-80 ℃冰箱中备用，同时采用同样的方法采集保存‘黑比诺’和‘无核白’的叶片、花蕾、花、胚珠、茎、根等组织器官。

1.2 VviSEP2基因的克隆

使用拟南芥MADS-box基因搜索葡萄基因组数据库12x.2(https://urgi.versailles.inra.fr/Species/Vitis/Data-Sequences/Genome-sequences)，将所有E值<0.01的序列在NCBI公共数据库中进行比对，获得NCBI中对上述序列的预测基因序列，并根据sNCGGa (international super-nomenclature committee for grape gene annotation)所制定的葡萄基因命名系统对葡萄SEP亚家族基因进行命名。挑选VviSEP2的预测序列(XM_002263003.3)为参考，在ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)中找出预测序列的最大开放阅读框ORF(open reading frame)，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，VviSEP2-F：5′- AACCTTAGATACCCACCAC-3′；VviSEP2-R：5′- CAATTCAAACAGTCTCATGC-3′。以‘无核白’葡萄胚败育过程中的胚珠全长cDNA文库为模板进行PCR扩增，并使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，胶回收正确片段后连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LB (Luria-Bertani) 培养基上进行蓝白斑筛选，挑选单克隆进行菌液PCR检测，检测正确后测序。将测序得到的序列与预测序列进行比对，相似性大于99%则认为克隆得到该基因。PCR反应体系：模板(50 ng/μL)1 μL，正向和反向引物(10 μmol/L)各1 μL，10×LA PCR Buffer (Mg2+plus)2.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.3 μL，加ddH2O补齐至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，12 ℃保存。

1.3 VviSEP2基因的序列分析

将克隆得到的VviSEP2基因cDNA序列在ORF Finder中找出最大ORF，利用NCBI的BLASTP对ORF预测蛋白序列进行保守结构域预测；利用Expasy的ProtParam预测蛋白的基本性质；在GenBank中收集拟南芥和葡萄MIKC亚类基因编码的蛋白序列，并利用DNAMAN和MEGA6.0软件分别进行多序列比对分析和进化分析。

1.4 VviSEP2基因的表达分析

按照购买的OMEGA植物RNA小量提取试剂盒(R6827-02，Plant RNA Kit)说明书中的步骤，分别从‘黑比诺’和‘无核白’葡萄各时期胚珠，‘黑比诺’与‘无核白’的叶片、花蕾、花、胚珠、茎、根等组织器官中提取葡萄总RNA，并用DNase进行纯化，琼脂糖凝胶电泳检测RNA品质后选取高品质的RNA反转录合成cDNA第一链。将得到的cDNA稀释到100 ng/μL后作为半定量分析的模板，以Actin基因为内参，引物Actin-F：5′-CTCTATATGCCAGTGGGCGTAC-3′，Actin-R：5′-CTGAGGAGCTGCTCTTTGCAG-3′。根据VviSEP2测序得到的序列为模板设计特异引物，RT-VviSEP2-F：5′-AACCTTAGATACCCACCACCCA-3′，RT-VviSEP2-R：5′-CACTCTTCCTCTCCCCATTCTC-3′。半定量分析的反应体系为：‘黑比诺’和‘无核白’葡萄叶片、花蕾、花、胚珠、茎、根的cDNA及其8个时期胚珠cDNA的等量混合液1 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，9.8 μL 2×Taq Mastermix，ddH2O补齐至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57～60 ℃(根据引物不同而不同)30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

qRT-PCR使用iQ5 Real-Time PCR仪器(Bio-Rad，美国)，每个PCR反应进行3个技术重复。反应体系为：‘黑比诺’和‘无核白’葡萄各时期胚珠cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，2×SYBR®PremixExTaqTMⅡ 10 μL，ddH2O 7.4 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58～60 ℃ 30 s，40个循环。以Actin基因为内参，不同样品间的相对表达量用2-ΔΔCt方法进行计算。

1.5 数据处理

采用Excel制图，‘黑比诺’和‘无核白’VviSEP2基因在花后胚珠发育过程中的定量表达差异通过t-test分析，以P<0.05表示具有差异性。

2 结果与分析

2.1 VviSEP2基因的克隆与序列分析

用VviSEP2-F和VviSEP2-R在‘无核白’葡萄胚败育过程中的胚珠全长cDNA文库中扩增出长约1 000 bp的目的片段，与预期大小相符。测序获得序列长度为1 132 bp的cDNA序列，通过ORF Finder 找到一个长741 bp的最大开放阅读框，编码246个氨基酸，预测的蛋白分子质量为28.03 ku，等电点(PI)为8.220。将所得序列与参考序列ORF 进行比对，发现两者核酸同源性为99.73%，确认克隆得到VviSEP2基因。将克隆基因推测的蛋白质序列与葡萄其他MIKCC亚类基因编码的蛋白序列进行比对，结果(图1)发现，VviSEP2具有MADS和keratin-like(K)保守结构域。同时,对从GenBank中收集的拟南芥和葡萄MIKC亚类基因编码的蛋白序列构建系统发育树，根据sNCGGa所制定的葡萄基因命名系统，将该基因命名为VviSEP2(图2)。

Vvi.葡萄；Vvi后其他字符代表MIKCC基因各成员名称；图2同。黑色方框表示保守结构域；背景色表示相似的氨基酸序列Vvi.Vitis vinifera;Other characters after Vvi are names of MIKCC family members;The same for Fig.2.The black boxes indicate the conservative domains, and background colors indicate similar amino acid sequences.图1 VviSEP2与葡萄其他MIKCC基因编码氨基酸序列的比对分析Fig.1 Amino acid sequence alignment of MIKCC genes of Vitis vinifera

At.拟南芥；分支上的数字表示100次重复抽样中符合聚类的百分数，枝长与实际进化距离不成比例At.Arabidopsis thaliana;The numbers on the branches represent the percentages of 100 replicates that the species are grouped together in the bootstrap analysis,and the branches are not drawn in proportion to their lengths图2 葡萄及拟南芥中MIKCC基因的进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of MIKCC genes of Arabidopsis thaliana and Vitis vinifera

2.2 VviSEP2基因的组织特异性表达

由图3可知，VviSEP2基因只在‘无核白’与‘黑比诺’葡萄的生殖器官(花蕾、花和胚珠)中有表达，具有组织特异性表达特征。VviSEP2基因在‘黑比诺’葡萄各生殖器官中的表达水平基本一致，而在‘无核白’葡萄胚珠中的表达水平明显高于花蕾和花中。同时还发现VviSEP2基因在‘黑比诺’葡萄花蕾和花中的表达水平高于其在‘无核白’葡萄花蕾和花中的表达水平。

2.3 VviSEP2基因在葡萄种子发育过程中的表达

通过实时荧光定量PCR 技术，对葡萄SEP2基因在‘黑比诺’和‘无核白’葡萄胚珠发育过程中的相对表达水平进行分析，结果(图4)显示,该基因在‘黑比诺’葡萄胚珠发育过程中的相对表达水平在花后10～45 d呈现递减趋势，而在‘无核白’葡萄中则基本不变。同时，VviSEP2在‘黑比诺’中的相对表达水平在整个胚珠发育过程中均显著高于‘无核白’，是‘无核白’相对表达水平的3～5倍。

1～6分别表示根、茎、叶、花蕾、花和胚珠1-6 represent root,stem,leaf,flower bud,flower and ovule图3 VviSEP2基因在‘无核白’和‘黑比诺’不同组织中表达的半定量分析Fig.3 Tissue specific analysis of VviSEP2 gene in ‘Thompson Seedless’ and ‘Pinot Noir’

图4 VviSEP2基因在花后胚珠发育过程中的定量表达情况Fig.4 Expression of VviSEP2 gene during the ovule development after bloom

3 讨论与结论

本研究运用PCR技术克隆获得一个‘无核白’胚珠败育相关基因，经过序列分析发现，该基因具有MADS-box家族M和K保守结构域；对拟南芥与葡萄中MADS-box家族成员进化树的分析表明，该基因是MADS-box中SEP亚家族成员之一；根据sNCGGa所制定的葡萄基因命名系统，将该基因命名为VviSEP2；组织特异性表达分析结果显示，该基因仅在葡萄的生殖器官(花蕾、花和胚珠)中特异表达，这与Reinheimer等[24]发现的SEP类似基因在多个禾本科植物中的表达模式相似，说明SEP基因在植物中的表达模式较为保守，同时也表明VviSEP2与葡萄生殖器官发育相关。

目前为止，对于SEP亚家族基因的研究多与花器官相关，而与种子发育关系的研究却鲜有报道。2003年，Favaro等[29]发现,将SEP基因突变后，拟南芥中胚珠的发育会受到影响，且突变体的表型与stk/shp1/shp2三突植株的表型有相似之处，且胚珠发育相关的AG蛋白必须在SEP存在的情况下才能与STK、SHP1和SHP2互相作用，AG蛋白可能与SEP以及STK、SHP1和SHP2中的一个形成转录因子复合体促进胚珠发育，说明这些胚珠发育相关基因功能的发挥离不开SEP亚家族基因的协助，SEP基因与胚珠发育相关。2007年，Brambilla等[30]在胚珠原基中发现一个与胚珠败育相关的转录因子BEL1，且BEL1的突变会加强stk/shp1/shp2三突植株的突变表型，但BEL1与胚珠发育相关的MADS-box蛋白复合体必须通过SEP转录因子介导后才能互作，再次说明SEP亚家族基因参与植物胚珠的发育过程。Matias-Hernandez等[22]在2010年发现，VDD转录因子在种子发育早期发挥重要作用，而SEP3和STK可以形成胚珠发育相关的蛋白复合体并直接作用于靶基因VDD的启动子区域，SEP3与种子的发育相关。本研究对VviSEP2在有核葡萄‘黑比诺’和无核葡萄‘无核白’胚珠发育过程中的表达模式进行分析发现，该基因在‘黑比诺’中的相对表达水平在整个胚珠发育过程中都显著高于‘无核白’，是‘无核白’相对表达水平的3～5倍，这表明VviSEP2基因与胚珠败育型无核葡萄胚珠的败育有一定关系。Mellway等[31]发现，转录因子VviSEP2可以与VviAG3存在相互作用，而VviAG3是拟南芥中胚珠发育相关基因STK在葡萄中的直系同源基因。胚珠发育相关基因VviSEP2在‘无核白’胚珠中的低水平表达，可能会影响到葡萄胚珠发育相关转录复合体的形成，从而导致胚珠败育，当然此假设还有待于进一步研究证明。

本研究在‘无核白’葡萄中克隆得到一个无核白胚珠败育相关基因VviSEP2，经过序列分析发现该基因cDNA序列长度为1 132 bp，ORF为741 bp，编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认该基因是E类MADS-box基因家族成员，具有MADS-box家族M和K保守结构域。表达分析发现该基因只在葡萄生殖器官表达，且在‘无核白’和‘黑比诺’胚珠发育过程中呈现不同的表达模式，表明葡萄VviSEP2基因与无核葡萄胚败育相关。