不同pH下碱性磷酸酶对As(Ⅴ)污染的响应

赵翊明，王紫泉，田海霞，和文祥，李道恒

(西北农林科技大学 资源环境学院,农业部西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西 杨凌 712100)

砷是自然界丰度排第20位的具有较强毒性和致癌作用的类金属元素[1]，被称为土壤五大污染元素之一。自然界中超过245种矿物中含有砷，人类活动，如采矿、化石燃料燃烧、农药使用等都会造成环境砷污染[2]。目前我国受砷、镉、铅等污染耕地近2.0×107hm2，占耕地总面积的20%以上[3-4]，其中尤以云南、内蒙古、湖南等地最严重，如湖南石门县雄黄矿附近土壤砷含量最高达296 mg/kg[5]。砷在土壤中主要以无机离子形态存在，主要有As(Ⅴ)与As(Ⅲ)两种价态，其中As(Ⅲ)比As(Ⅴ)生物毒性更强[6-7]。在自然环境中，氧化还原电位(Eh)和酸碱度(pH)是影响砷存在价态的主要因素[8-9]；当pH+pE>10或<8时，As(Ⅴ)和As(Ⅲ)分别成为环境中的主要形态[1,10]。同时，由我国《土壤环境质量标准》(1995年)中可以看出，碱性条件下土壤的砷污染临界值小于酸性条件下，砷的毒性更强。

土壤酶是具有催化能力的土壤组分中最为活跃的成分之一，它参与土壤物质循环和能量代谢，是土壤中重要的生物活性指标。磷酸酶是土壤磷循环中的重要酶类，可水解有机磷为无机磷，为作物生长提供有效磷。依据最适pH不同，磷酸酶可分为酸性、中性和碱性磷酸酶。近年来，国内外学者对砷污染的酶效应进行了研究，结果总体表现为抑制、激活及不变3种规律[6,11-14]。可见由于供试样品、砷价态等条件不同，造成研究结果不尽一致，难以相互比较。此外，大多数研究直接利用土壤酶完成，鲜有采用不同状态酶进行重金属污染的研究，很难深入探讨砷与酶的作用机理；加之，pH是影响砷价态与毒性的主要因素之一，特别是在碱性pH条件下，砷的生物毒性更强，但其如何影响砷与酶之间的关系却鲜见报道。鉴于此，本试验拟在不同pH条件下，研究不同状态(游离态、固定态、土壤)碱性磷酸酶活性与砷污染之间的关系，揭示碱性磷酸酶活性与砷污染及pH的关系，探明不同条件下砷对酶的作用机理，为判断砷污染程度、评价土壤质量及完善土壤酶理论提供依据。

1 材料与方法

1.1 游离态和固定态碱性磷酸酶的制备

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphate，ALP)储备液制备：称取碱性磷酸酶(购自Sigma公司，酶活性≥10 EDA)0.150 0 g，溶于pH 8.8的Tris-HCl缓冲溶液，定容，最终酶质量浓度为3 mg/mL，于4 ℃冰箱保存备用。使用时分别将储备液稀释成游离态碱性磷酸酶(Free ALP,F-ALP)溶液(0.03 mg/mL)以及M工作液(0.06 mg/mL)。

固定态碱性磷酸酶(Immobilized ALP by montmorillonite,M-ALP)制备：取游离态碱性磷酸酶M工作液2 mL，加入10 mg/mL蒙脱石((Al,Mg)2[Si4O10](OH)2·nH2O，AR)悬液2 mL，25 ℃、250 r/min振荡2 h，12 000 r/min离心15 min，取沉淀物用pH 7.5 Tris-HCl缓冲液离心洗涤3次后，用4 mL pH 7.5 Tris-HCl缓冲液重新悬浮，充分分散后得固定态碱性磷酸酶，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 供试土壤

采自我国内蒙古自治区未污染农田土壤(41°20′N,109°50′E)的栗钙土(Calci-Ustic Isohumosols)。采样时先去除表层(0～5 cm)土，用五点采样法取5～20 cm土层土样，混匀风干，过孔径1 mm尼龙筛备用。土壤理化性质[15]为：有机质含量16.30 g/kg，pH 8.80(水土体积质量比2.5∶1)，全氮含量0.96 g/kg，全磷含量0.38 g/kg，全钾含量26.40 g/kg，速效磷含量7.01 mg/kg，速效钾含量177.99 mg/kg，阳离子交换量11.61 cmol/kg，黏粒含量10.51%，总砷含量0.17 mg/kg(测定砷含量时加入2个国家标准土壤样品GSS 9和GSS 10进行质量控制。GSS 9和GSS 10的标准As含量分别为(8.4±1.3)，(8.9±0.9) mg/kg，本试验测得的结果分别为8.27和9.02 mg/kg)。

1.3 不同pH下游离态、固定态碱性磷酸酶对As(Ⅴ)污染响应的试验方案

吸取0.2 mL F-ALP或M-ALP溶液，分别添加0.2 mL不同质量浓度(0，10，25，50，100，200，300，400 mg/L)As(Ⅴ)溶液(配制砷溶液采用的砷化合物试剂为Na3AsO4，化学纯)，污染30 min后分别添加pH 7.0，8.0，9.0，10.0 的0.005 mol/L磷酸苯二钠底物缓冲溶液2 mL，摇匀后于37 ℃培养，在510 nm下用比色法测定酶活性[16]，同时用pH计电极法测定溶液的pH，用pH计铂电极直接测定法测定溶液的Eh。游离态、固定态碱性磷酸酶活性分别以1 h 内单位ALP(μg)、蒙脱石(mg)产生的酚量(μg)表示。

1.4 不同pH下土壤碱性磷酸酶对As(Ⅴ)污染响应的试验方案

称取土样3.00 g于50 mL三角瓶中，添加0.15 mL甲苯，15 min后分别加入3 mL不同质量浓度(0，10，25，50，100，200，300，400 mg/L)As(Ⅴ)溶液，污染30 min后分别添加pH 7.0，8.0，9.0，10.0的0.5%磷酸苯二钠底物缓冲溶液20 mL，充分振荡后于37 ℃培养，测定土壤碱性磷酸酶(Soil ALP，S-ALP)活性、pH和Eh。土壤碱性磷酸酶活性以1 h 内单位干土(g)产生的酚量(μg)表示。

酶活性抑制率=(1-处理酶活性/对照酶活性)×100%。

pE=n×F×Eh/(2.303×R×T)。

式中：n为电子转移数；F为法拉第常数， 其值为6.564 kJ/V；Eh为氧化还原电位；T为绝对温度；R为气体常数，其值为8.314 J/(mol·K)。

1.5 数据处理

采用 Microsoft Excel 2007、Origin Pro 8.5和SPSS 19.0 软件对试验数据进行分析及模型拟合，LSD法对各处理间差异进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 碱性磷酸酶对As(Ⅴ)污染响应过程中pE的影响

不同pH下碱性磷酸酶对As(Ⅴ)污染响应过程中pE的影响见图1。从图1可以看出，pE随pH升高而减小，除pH 10.0时3种碱性磷酸酶pE差异达到显著水平外，其余pH条件下不同状态碱性磷酸酶之间pE值差异较小。 pH 10.0时土壤碱性磷酸酶pE最小，为4.24；pH 7.0时固定态碱性磷酸酶pE最大，为6.49，二者相差1.53倍。本试验中pH+pE为13.24～14.39，当pH+pE>10时，环境中砷主要以As(Ⅴ)存在[7]，故可判断本试验过程中砷并未发生还原反应，均以五价存在。

图柱上标不同小写字母表示相同pH下不同体系的pE差异显著(P<0.05)Different lowercase letters mean significant difference at P<0.05图1 不同pH下碱性磷酸酶对As(Ⅴ)污染响应过程中pE的影响Fig.1 Effects of pH on pE in the response of ALP to As (V) pollution

2.2 砷污染下碱性磷酸酶活性的响应

选取pH 10.0为代表，分析As(Ⅴ)对3种碱性磷酸酶活性的影响,结果见表1。

表1 pH 10.0下As(Ⅴ)对碱性磷酸酶活性的影响Table 1 Effect of As (V) on alkaline phosphatase activity at pH 10.0

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters mean significant differece atP<0.05.

从表1可以看出，砷加入导致碱性磷酸酶活性总体减小，表明砷抑制了3种碱性磷酸酶活性。砷质量浓度较低(<10 mg/L)时，碱性磷酸酶活性表现出激活，但是与CK差异不显著。在相同质量浓度下，砷对固定态碱性磷酸酶的影响小于游离态碱性磷酸酶，对土壤碱性磷酸酶的影响更小。当砷质量浓度为400 mg/L时，砷对游离态、固定态、土壤碱性磷酸酶的抑制率分别为59.61%，20.81%，19.90%，可见As(Ⅴ)污染下碱性磷酸酶活性降幅遵循土壤碱性磷酸酶<固定态碱性磷酸酶<游离态碱性磷酸酶的规律性变化，表明载体对酶具有保护作用，同时可缓冲砷的毒性，揭示载体形态在酶与重金属关系研究中具有重要作用。

2.3 pH对砷与碱性磷酸酶活性关系的影响

pH对As (V)与碱性磷酸酶活性关系的影响见图2。

图柱上标不同小写字母表示同一pH下As(Ⅴ)浓度间不同碱性磷酸酶活性的差异显著(P<0.05)Different lowercase letters on bars mean significant difference at P<0.05图2 pH对As(V)与碱性磷酸酶活性关系的影响Fig.2 Effect of pH on the relationship of As(V) and alkaline phosphatase activity

从图2 可以看出，砷未污染时，3种碱性磷酸酶活性均随pH升高而增大,pH 10.0时，游离态碱性磷酸酶、固定态碱性磷酸酶、土壤碱性磷酸酶活性分别为pH 7.0，8.0，9.0时的4.56，3.50，2.744倍；2.79，2.47，1.11倍；3.91，2.38，1.21倍。砷污染条件下，3种碱性磷酸酶活性也随pH升高而增加,其中pH 10.0时游离态碱性磷酸酶活性明显高于pH 为9.0，8.0，7.0，pH 10.0，9.0时固定态碱性磷酸酶、土壤碱性磷酸酶活性明显高于pH 为8.0，7.0。砷对碱性磷酸酶活性的抑制率随pH增加而增大，即砷对碱性磷酸酶的毒性随pH的升高而增大,例如砷质量浓度达到200 mg/L时，游离态碱性磷酸酶活性在pH 7.0，8.0，9.0，10.0时的抑制率分别为21.07%，35.01%，40.46%，43.11%；固定态碱性磷酸酶活性在pH 7.0，8.0，9.0，10.0时的抑制率则分别为8.36%，9.69%，11.88%，16.11%；土壤碱性磷酸酶活性在pH 7.0，8.0，9.0，10.0时的抑制率分别为3.62%，9.11%，15.89%，14.10%。

采用完全抑制模型E=A/(1+B×C)对不同碱性磷酸酶活性(E)与砷质量浓度(C)之间关系进行拟合，结果(表2)显示，拟合模型的决定系数均达到极显著水平，表明拟合模型可较好地表征碱性磷酸酶活性与砷质量浓度间关系，且在较宽的pH范围内，碱性磷酸酶在一定程度上可表征环境中砷的污染程度，并揭示出其机理主要为完全抑制作用。生态剂量(酶活性变化10%时外界污染物的质量浓度，ED10)随pH增大而减小，即pH越小，对砷毒性的缓冲能力越大。pH 7.0，8.0，9.0时游离态碱性磷酸酶、固定态碱性磷酸酶、土壤碱性磷酸酶的ED10是pH 10.0时的2.40，1.44，1.14倍；2.63，1.45，1.83倍；1.37，1.16，1.26倍。固定态碱性磷酸酶及土壤碱性磷酸酶生态剂量值均大于游离态碱性磷酸酶，但三者的生态剂量均低于《土壤环境质量标准》(1995年)三级标准(40 mg/kg)，表明在一定程度上，碱性磷酸酶对砷毒性更加敏感。

表2 不同 pH下碱性磷酸酶活性(E)与砷质量浓度(C)之间关系的拟合结果Table 2 Regression equations between alkaline phosphatase activities(E) and As concentrations(C)

注： **表示相关性达极显著水平(P<0.01)。下表同。

Note: ** indicates the correlation reached the extremely significant level atP<0.01.The same below.

2.4 砷与环境条件对碱性磷酸酶活性的交互作用

为探讨pH、pE、砷等因素对碱性磷酸酶活性的影响，对其进行了方差分析，结果(表3)可见，砷质量浓度、pH+pE均极显著影响3种碱性磷酸酶活性，且两因素间存在极显著的交互作用，即最终的碱性磷酸酶活性是由砷与其pH、Eh等因素共同决定的，这也从侧面反映出研究砷对碱性磷酸酶活性影响时需充分考虑pH、Eh的影响。

表3 pH、pE和砷对碱性磷酸酶活性影响的方差分析Table 3 ANOVA analysis of alkaline phosphatase activity in tested samples

3 讨 论

本研究中，碱性磷酸酶活性随pH的升高而增大。由于本试验中采用碱性磷酸酶的最适pH为9.8，pH为10.0时几乎达到了其最适条件，故其活性显著大于其余pH条件下。pH 9.0时固定态碱性磷酸酶活性已明显高于pH 7.0和8.0时，表明固定态碱性磷酸酶相对于游离态碱性磷酸酶对pH敏感程度降低。这可能是由于，一方面蒙脱石和土壤对pH的变化具有一定的缓冲性；另一方面当酶被固定在蒙脱石上后，pH对酶活性特征的影响发生了变化[17]。对黏土矿物固定态酸性磷酸酶及β-葡萄糖苷酶等的研究也证实了固定态酶能够降低pH的敏感程度[18-19]。土壤碱性磷酸酶活性随pH升高变化较为平缓。这是因为土壤系统更加复杂，土壤中碱性磷酸酶的最适pH为8.0～10.0[20]，土壤碱性磷酸酶活性受土壤性质影响较大，导致其对pH的敏感程度较游离态或者单一蒙脱石固定态酶活性小。

本研究结果显示，砷污染抑制了碱性磷酸酶活性，且抑制率随pH升高而增大，表明pH升高，砷对碱性磷酸酶的毒性增大。此外，ED10随pH升高而减小，也证实pH是影响砷毒性的重要因子。随pH升高，砷酸盐存在形态从近中性条件下的一价阴离子向强碱性条件的三价阴离子转变，这种变化导致砷在溶液中移动能力增强，更容易与碱性磷酸酶结合，从而导致对酶的抑制增强。重金属对酶活性的抑制主要通过与酶活性中心结合阻止底物与酶反应，或者改变酶的构象，或者与底物反应等方式产生作用。砷对碱性磷酸酶的抑制为竞争性抑制，砷酸盐与磷酸盐结构相似，砷通过与酶活性中心结合阻止了酶-底物复合物形成而对其活性产生抑制[10]。有研究显示，砷对碱性磷酸酶的抑制常数(Ki)小于米氏常数(Km)，表明相同砷质量浓度下，砷与碱性磷酸酶的结合能力要强于底物与其结合的能力[21]。pH升高，砷与碱性磷酸酶的结合能力增强，从而导致砷对碱性磷酸酶的抑制增强。

本研究结果显示，砷对不同状态下碱性磷酸酶活性抑制率表现为，游离态碱性磷酸酶>固定态碱性磷酸酶>土壤碱性磷酸酶；同时，ED10也表现出同样的规律。揭示了固定态或土壤碱性磷酸酶对砷的敏感度降低，蒙脱石和土壤对碱性磷酸酶的固定能够降低砷对碱性磷酸酶的毒性。蒙脱石、土壤对酶有吸附固定的作用，这种作用可以提高酶对外界环境胁迫的稳定性，使酶对外界胁迫的敏感度降低[18-19]，即酶对砷的敏感度降低。类似研究也发现，针铁矿和氧化锰矿物固定后的酸性磷酸酶对Cu的敏感度降低[22]；Cu胁迫下，针铁矿对β-葡萄糖苷酶具有保护效应，其原因是针铁矿对Cu有较强的吸附[23]。同时，黏土矿物、土壤等载体有巨大的表面积及表面能，对砷有较强的吸附作用[1,2,10]，并且对As(Ⅴ)的吸附要强于As(Ⅲ)[10]。在氧化条件下，As(Ⅴ)是稳定存在的形态，其可以强烈吸附于黏土矿物、铁锰氧化物(氢氧化物)及有机质中[1]，在一定程度上缓解砷对酶活性的毒性[24]，起到了对酶的保护作用。

4 结 论

砷对碱性磷酸酶活性的抑制作用随pH升高而增大，砷毒性增强。模型E=A/(1+B×C)可较好地表征砷质量浓度(C)与碱性磷酸酶活性(E)之间的关系。在供试pH范围内，碱性磷酸酶在一定程度上可作为表征环境中砷污染的指标，并反映出其间的作用机理为完全抑制作用。3种状态碱性磷酸酶ED10值均远低于国家《土壤环境质量标准》(1995年)中砷的三级污染临界值，揭示碱性磷酸酶是较为灵敏的砷污染评价指标。砷对固定态及土壤碱性磷酸酶活性的抑制率小于游离态碱性磷酸酶。酶固定介质土壤对砷的毒性具有缓冲作用，对酶活性具有保护效应。