低温等离子体辅助聚乳酸表面接枝乳酸链球菌素及抗菌性

户帅锋 王洁卿 李鹏辉 高 明 韦宗伟 王怀雨 王 喆

1(深圳市中科摩方科技有限公司 深圳 518114)2(中国科学院深圳先进技术研究院 深圳 518055)

1 引 言

抗菌活性包装是目前食品及材料领域研究开发的一个前沿和热点，是将抗菌剂混入高聚物包装材料中，使其具有抗菌活性的包装方法。抗菌活性包装可以缓慢地释放出抗菌剂，在包装内部维持长期稳定的抗菌剂浓度，达到抗菌防腐的目的，以逐渐减少或代替向食品中加入的防腐剂[1]。其替代了传统的向食品中添加抗菌剂的食品保藏方法，能长时间保持食品的营养和风味，延长货架期，提高安全性，能够有效解决高水分活度食品的抗菌防腐难题。

目前应用的抗菌活性包装分为两类：(1)将抗菌剂包埋在基材内部或直接涂抹在表面，通过向食品表面释放抗菌剂实现抗菌活性，同时又通过控制抗菌剂的迁移溶出速率，实现持续性抗菌；(2)将抗菌剂分子与基材通过化学键等方式结合，固定在基材表面，使其不溶出，通过材料与食品的紧密接触来实现抗菌活性，并阻止环境中微生物对食品的侵蚀，能够长期保持抗菌活性[2]。

抗菌包装体系主要包括包装基材、抗菌剂和食品三个部分。食品的货架期除受自身因素影响外，还取决于包装材料的特性。但现在常用的塑料包装不易降解，容易造成白色污染，所以对可降解包装材料的研究，一直是包装领域的研究热点。聚乳酸(Polylactic Acid，PLA)是一种原材料来源广泛，废弃后不会造成污染，且很有发展前途的高分子材料[3]，非常适合做食品活性包装基材。但 PLA 也存在一些缺点，如无抗菌性等。这些缺点限制了其在活性抗菌食品包装领域的进一步应用。

乳酸链球菌素(Nisin)是一种天然多肽抗菌素类物质，在食品工业中应用广泛[4,5]。Nisin 作为一种安全高效新型天然防腐剂，在国内外均得到认可，并且已经应用到食品行业的各个领域。将Nisin、壳聚糖和茶多酪复合配比对新鲜冷却羊肉进行冷却保鲜证明，Nisin 具有很好的抑菌效果，并发现壳聚糖和 Nisin 之间具有很好的交互反应[6]。采用不同浓度的葡聚糖和海藻糖对 Nisin进行热处理后稳定性的影响研究。实验结果表明，添加葡聚糖和海藻糖均能提高 Nisin 热处理后的效价[7]。用葡萄提取物、Nisin 和乙二胺四乙酸与大豆分离蛋白复合的可食性薄膜不仅具有较好的物理性质，而且还有较高的抗菌活性[8]。

等离子体改性技术能快速、高效地引发常规反应中不能或很难实现的物理或化学变化，赋予膜材料表面各种优异性能，而不改变基体材料本身的性质，是拓展高分子膜材料应用范围的一种重要方法[9]。将高分子材料进行表面改性，达到高性能或高功能，是经济有序地开发新材料的重要功能。近年来，利用低温等离子体技术对高分子材料表面改性的研究十分活跃，其改性优点具体体现在[10]：(1)赋予改性表面各种优异的性能；(2)表面改性层，厚度极薄(从几纳米到几百纳米)，整体性质基本不变；(3)可以赋予一些材料本身不具有的性能，如抗菌特性等。

本文将利用低温等离子体技术，在低真空的条件下对 PLA 膜进行表面改性，并对其表面性能进行表征。通过用 Nisin 溶液浸泡，从而使Nisin 接枝在改性的 PLA 薄膜表面，赋予 PLA 薄膜抗菌活性，促进其在食品包装领域的应用。

2 材料与方法

2.1 材料

PLA 薄膜(4032D，厚度：40 μm)购自深圳光华伟业有限公司；Nisin(900 UI/mg)购自上海源叶生物科技有限公司；L.monocytogenes菌株(ATCC19115)购自广东微生物菌种保藏中心。

2.2 低温等离子体处理

低温等离子体处理(Cold Plasma Treatment，CPT)采用自制的等离子体设备(400 kHz，200～500 W)。其中，等离子体设备的反应室直径为 100 nm，两个电极板之间的距离为 25 mm。在(20±5)℃ 的环境下，PLA 薄膜样品尺寸为50 mm×50 mm。实验中，首先将反应室抽真空至 100 Pa(无气体通入)，样品在功率为 300 W 的条件下分别处理 0、15 s、30 s、45 s 和 60 s，并依次命名为 PLA0、PLA15、PLA30、PLA45 和PLA60；然后，将处理后的样品放置于温度为(20±5)℃、相对湿度为 50% 的条件下保存待用。

2.3 Nisin 涂膜处理

首先，将 Nisin 溶于蒸馏水，在室温下以100 rpm 的速率搅拌 1 h 后，获得 10 mg/mL 的Nisin 溶液。然后，Nisin 溶液经过 5 300 rpm 冷冻离心 20 min，取上清液置于－20℃ 冷藏待用。最后，在(20±5)℃ 环境下，将 PLA0、PLA15、PLA30、PLA45 和 PLA60 分别置于解冻后的 Nisin 溶液中 2 min，再置于 40℃ 条件下烘干 6 h。将获得的薄膜分别命名为 PN0、PN15、PN30、PN45 和 PN60，以上 5 组样品合称为PLA Nisin 薄膜，即 PN 薄膜。

2.4 薄膜的性能表征

2.4.1 原子力显微镜

将膜样品取一小片后，置于原子力显微镜(Bruker MultiMode 8，Bruker，德国)中，采用非接触方式工作，谐振频率约为 267 kHz，操作在手套箱(氧气含量＜0.1 ppm，水蒸气含量＜0.1 ppm)中完成。利用该手段，主要对 PLA 薄膜的粗糙度进行表征。

2.4.2 水接触角

选用固体石蜡和玻璃作为基板材料。实验前，对固体基板表面进行抛光和清洗处理。人工抛光后，首先分别用清洁剂、自来水、蒸馏水超声清洗 15 min；然后，将基板取出在无水酒精中清洗 10 min，室温下置于滤纸上吹干；最后，用微量注射器垂直缓慢地将 5 µL 膜液滴到水平放置的固体基板上，使用接触角测定仪(OCA20，Dataphysics Co. Ltd.，德国)测定膜液接触角。相同试验重复 3 次，结果取平均值。

2.4.3 抗菌性能测试

将L.monocytogenes菌株(ATCC19115)接种于脑心津液琼脂培养基表面，在 37℃ 恒温培养箱中活化培养 24 h，然后在胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)中进行两次传代培养恢复菌株活性。用生理盐水进行梯度稀释，得到 105CFU/mL的L.monocytogenes菌液待用。其中，CFU 为菌落形成单位(Colony-Forming Units)。

取 2.5 mL 105CFU/mL 的L.monocytogenes菌液接种于 22.5 mL TSB-YE 中。将 PLA、PN0、PN15、PN30、PN45 和 PN60 分别加入上述溶液中作为 6 个实验组，领取一组不加任何薄膜作为空白对照。每组均做 3 个平行，置于摇床中以 250 rpm 的速率震荡培养 1 h。经过梯度稀释后，进行平板计数。

3 结果与讨论

3.1 粗糙度

图1 低温等离子体处理对 PLA 薄膜表面性能的影响Fig. 1 The effect of cold plasma treatment on the properties of PLA film surface

由图1可知，随着处理时间的延长，薄膜表面平均粗糙度(Ra)先增大后减小。这是由于低温等离子体放电过程中产生的高能活性粒子、离子、自由基等，在处理中不断轰击 PLA 膜表面，碰撞传导的能量远超过材料表面原子的结合能，引发化学键断裂，产生表面刻蚀现象。但是，我们也可以看到，当处理时间超过 30 s 后，PLA 薄膜的粗糙度呈下降趋势，这与常规看起来并不相符。

研究显示，等离子体能量的增加导致分子单体断裂成更多片段，因此薄膜的粗糙度随着等离子体射频的增加而减小[11]。另有研究表明，经过氦气和氩气等离子体处理后，薄膜表面的凸起被刻蚀，薄膜粗糙度更加均匀，更加平滑[12]。而大气等离子体处理的薄膜，由于空气中氧气的刻蚀作用更强，导致薄膜表面粗糙度增大。处理方式是影响薄膜表面粗糙度的一个因素，另一个因素则是薄膜的内在结构[13]。PLA 在挤出成型过程中，由于退火温度的不同，导致薄膜表层和内部的结晶度、均匀性不同。薄膜表面的分子结构大多都是无定型态，结构更加松散，相对于内层更容易被刻蚀。在 100 Pa、无处理气体的条件下，高能量的离子和 PLA 易刻蚀的表层导致处理时间超过 30 s 后薄膜逐渐变得光滑。

3.2 接触角

接触角测量是一种快速、简单的研究材料表面性能变化的方法。图1 为水滴在膜表面 3 s 内接触角的变化趋势。未经等离子体处理改性的PLA 膜的接触角为 82.5°，属于疏水性膜。随着等离子体处理时间的增加，PLA 薄膜的接触角先下降后上升，在 15 s 降至最低 51.06°(P＜0.05)；在 45 s 和 60 s 时分别上升至 77.8°、75°，与未处理薄膜间无显著差异(P＞0.05)。可见，薄膜的接触角变化与粗糙度变化呈负相关。有研究表明，粗糙度和化学性质的变化使材料表面的接触角与杨氏方程产生差异[14,15]。根据经典的润湿理论[16]，薄膜表面粗糙度的增加可以提高其在大气中的亲水性。上述两种理论证实，等离子体处理对 PLA 薄膜表面粗糙度的影响导致了其接触角的变化。

3.3 菌落总数分析

抗菌材料的抗菌活性取决于两个方面：一是抗菌剂自身的抗菌活性及经过挤出加工后的抗菌活性，这是材料具有抗菌活性的前提；二是抗菌剂从基材中的迁移溶出速率，这是材料具有抗菌活性的关键。对抗菌材料的制备和研究需要从这两个方面入手。Nisin 是由 34 个氨基酸组成的短肽，氨基酸残基赋予其亲水性和亲脂性。由于 Nisin 使L.monocytogenes菌体细胞内蛋白质溶出，破坏菌体细胞膜的完整性进而导致菌体裂解死亡[17,18]。因此，Nisin 对L.monocytogenes具有良好的抗菌效果。Shiroodi等[19]通过共混包埋的方式制备出含 Nisin 的大豆分离蛋白(PPI)、乳清分离蛋白(WPI)和 PLA薄膜，将上述薄膜置于L.monocytogenes菌液中经过 48 h 培养后，结果显示含有 Nisin 的PPI、WPI 和 PLA 薄膜中菌液的浓度分别上升至 6.0 log10(CFU/mL)、8.47 log10(CFU/mL)和9.0 log10(CFU/mL)。这表明包埋后的 Nisin 不能充分与菌接触，进而发挥其抑菌作用。本文选用L.monocytogenes作为抗菌对象，将 Nisin 接枝在PLA 薄膜表面，考察 PN 膜的抗菌活性。

等离子体处理对 PLA 表面 Nisin 接枝效果的影响如图2所示。经过 1 h 震荡培养后，空白对照组和 PLA 组的L.monocytogenes的菌落总数由初始的 4.0 log10(CFU/mL)分别增加至 5.61 log10(CFU/mL)、5.48 log10(CFU/mL)，但两者间无显著差异(P＞0.05)。而 PN0、PN15、PN30、PN45 和 PN60组的L.monocytogenes的菌落总数分别下降至3.01 log10(CFU/mL)、3.50 log10(CFU/mL)、3.47 log10(CFU/mL)、3.01 log10(CFU/mL)和2.25 log10(CFU/mL)，显示 Nisin 接枝后的 PN 薄膜具备不同的抑菌效果，且均好于 PLA 薄膜。抗菌效果不同表明接枝在薄膜表面的 Nisin 含量不同。经过等离子体处理的 PLA 膜表面粗糙度的变化导致接触面积增加，刻蚀作用导致表面自由基增多，可有效与 Nisin 进行接枝反应，从而具备一定的抗菌性能。在 Nisin 溶液浸泡后，等离子体处理前 45 s 和未经等离子体处理的 PLA 薄膜间的抗菌效果差异不显著(P＞0.05)，说明 Nisin 的接枝量差异不明显。随着低温等离子体处理时间延长至 60 s，PN60 的抑菌效果达到最佳。

图2 低温等离子体处理对 PN 薄膜抗菌性能的影响Fig. 2 The effect of cold plasma treatment on the antimicrobial properties of PN film surface

4 与国内外相似研究的对比分析

Xu 等[20]通过化学偶联的方法将 Nisin 接枝固定在聚醚酰亚胺薄膜表面，将其置于 10 mL 105CFU/mLS.aureus溶液中，经过 24 h 培养后，95.2% 的S.aureus被杀死。Aveyard 等[21]通过化学偶联的方法将 Nisin 接枝固定在经过氦气等离子体处理后的聚苯乙烯薄膜表面，以薄膜对L.monocytogenes和S.aureus的抑菌效果证明，不同条件下 Nisin 的接枝效果不同。因此，本文主要是通过 PN 膜的抑菌性能强弱来判断经等离子体处理的 PLA 薄膜与 Nisin 接枝的程度。其中，PN60 组的菌落总数最低(P＜0.05)，证明其具有最优的抑菌效果。

5 结 论

低温等离子体处理可明显改善 PLA 薄膜表面的物理性质。表征结果表明，平均粗糙度随着处理时间的增加先增大后减小，表面亲水性与粗糙度呈正相关。通过对抑菌性能的表征发现，PN60具有最好的抑菌效果，这说明低温等离子体处理60 s 后的 PLA 薄膜与 Nisin 的接枝效果最好。