昆虫体内共生菌鉴定方法的研究进展

向候君,蔡普默,季清娥,杨燕川,王 波,陈家骅

福建农林大学植物保护学院,福建 福州 350002

在昆虫体内通常存在多种微生物，如细菌、真菌、原生动物等，它们能够影响昆虫的某些重要生命活动过程[1,2]。研究昆虫肠道微生物不仅利于开发利用昆虫资源和害虫防治，而且能从昆虫肠道中获得某些特殊功能的细菌资源[3]，应用于植物病害的防治，控制动物疫病的传播等[4]。昆虫内微生物与宿主的相互关系已逐渐成为昆虫学研究的热点之一，此外，各种生物学技术在昆虫学、微生物学等领域的大量应用，也极大推动了昆虫体内微生物种类、多样性、功能、与宿主互作及协同进化关系的研究[1]。

由于微生物个体微小、结构简单，分类鉴定除了采用传统的形态学、生态学及生理学特征，还应寻找新的特征作为其分类鉴定依据[5]。人们对昆虫体内微生物的鉴定，最初以传统方法如生物分型、血清分型、抗微生物易感性试验、免疫印迹法、噬菌体分型和多位点酶电泳法等为主。这些方法统称为表型分类法，是以菌体的表现类型为依据对细菌进行分类和鉴定[6]。近年来，随着现代分子生物学理论和技术的发展，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术的出现，建立了一种新的分类系统—遗传型分类法，主要原理是对微生物的染色体DNA进行直接分析或对其染色体外DNA片段进行分析，进而从遗传进化角度去认识细菌，从分子水平对它们进行分类与鉴定[6]。目前，昆虫内共生菌的功能研究也进入了一个新的阶段。近几年，转录组学、蛋白质组学、基因组学以及新一代高通量测序工具和分析软件等，以及基因组学工具的进步及发展，促进了宿主昆虫共生机制及其内共生菌研究的发展，为从微观角度研究共生菌与宿主昆虫种群形成、扩散的共生机制提供了便利[7]。本文旨在对昆虫内共生菌鉴定的研究方法及其应用研究进行综述，为研究昆虫微生物的生物群落及功能机制等研究提供技术参考。

1 昆虫体内微生物的鉴定方法

1.1 传统的鉴定方法

在分子生物学技术的发展之前，对昆虫微生物的鉴定，主要采用传统的形态学和生理生化特性鉴定法，即宏观菌落形态学观察，以及生理生化实验如糖类、蛋白质和氨基酸代谢试验、胺盐和有机酸盐利用试验、毒性酶类试验、呼吸酶类试验等对其进行逐级鉴定[6]，之后再根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》等理论依据对得到的菌种进行分类鉴定[6,8]。如孟祥杰等[9]通过平板法从六斑异瓢虫Aiolocaria mirabilis的雌性成虫肠道中分离到5株细菌，通过观察菌落形态、细胞的生物学特征和生理生化特征等，分别鉴定为地杆菌属Terrabacter、李斯特菌属Listeria、纤维单胞菌属Cellulomonas、短小杆菌属Curtobacterium和皮杆菌属Demabacter细菌。

微生物鉴定方法包括分子遗传学鉴定法和表型鉴定法两类，其中表型鉴定法是对细菌形态和生理生化水平、蛋白质水平、细胞组分水平的鉴定，包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法[10,11]。为了改革和优化传统的鉴定技术，一些简便、快速、自动化的鉴定技术迅速发展起来，不但普及了鉴定技术，而且还大大提高了工作效率。具有代表性的如应用于各种细菌鉴定的“API”系统、“Biolog”系统[11]。

API鉴定系统：该系统包括15种鉴定条，可鉴定包括肠杆菌(API20E、API 10S、RapiD 20E)、革兰阴性杆菌(API 20NE)、厌氧菌(API 20A)、弯曲菌(API Campy)、棒状杆菌(API Coryne)、李斯特菌(API Listeria)、奈瑟氏-嗜血杆菌(APINH)、葡萄球菌(API Staph)、链球菌(API 20Strep)、酵母菌(API 20CAUX、API Candida)、乳杆菌和芽胞杆菌(API 50CH)等600种以上的细菌[12]。从橘小实蝇Bactrocera dorsalis3个种群(实验室正常喂养种群、实验室无菌糖水喂养种群、野生种群)成虫肠道中分离培养的600株细菌中得到53种不同细菌遗传型，在LB固体培养基上进行纯培养，然后对其菌落特征进行观察，主要分别从细菌形状、菌落形态、颜色、透明度、革兰氏染色、芽孢有无等方面进行区别鉴定[13]，之后采用法国梅里埃公司生产并由上海长源科学技术有限公司代理销售的ID32E肠杆菌科和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统及API 50CHB芽孢杆菌属鉴定系统对其成虫肠道可培养微生物进行鉴定，最终分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)和芽孢杆菌科(Bacillaceae)等3个科。其中肠杆菌科是肠道可培养细菌中最优势的细菌种类[13,14]。

Biolog微生物鉴定系统由浊读仪、读数仪、软件、数据库、微孔鉴定板组成，与计算机联网。对结果的鉴定需要考虑可能性(Probability)、相似性(Similarity)、位距(Distance)这3个参数；通过相似性(SIM)，位距(DIST)和可能性(PROB)值与数据库中的ID比较，确定被鉴定的微生物的属种。Biolog微生物鉴定系统的基本步骤：BUY培养基的配制；接种培养；平板划线；浊度调整；接种鉴定板；读取数据；结论与数据分析[5]。利用Biolog-Eco方法，对以抗虫转cry1Ab基因粳稻(KMD1/KMD2)及其对照(秀水11)为食的褐飞虱肠道微生物群落多样性进行比较研究，以评价其对该飞虱肠道微生物多样性的影响。室内和田间的研究结果均表明，以KMD1为食时，其微生物群落的平均颜色变化率（AWCD）明显高于以KMD2和对照为食[15]。

1.2 分子生物学方法

依靠传统的分离培养手段，且由于人们的认知条件限制，许多微生物尚难以被分离培养，因此对于揭示昆虫微生物区系的多样性有很大的局限性[4,6,16,17]。通过分子生物学方法研究的结果表明，人们只分离出了自然界0.1%～1.0%的微生物，99%以上的环境微生物是无法获得纯培养的[4,18,19,20]，因此以纯培养技术为基础对微生物进行的研究结果并不能完全代表其真实的情况。随着分子生物学的发展，基于核酸序列分析的现代分子生物学技术已广泛应用到昆虫微生物学研究中，即包括基于核酸水平的鉴定，对细菌染色体或质粒DNA进行分析的分子遗传学鉴定法[10,21]。目前，研究昆虫微生物多样性的分子生物学方法主要包括：变性梯度凝胶电泳（DGGE）、16S rRNA基因技术、分子杂交技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、扩增性核糖体DNA限制性酶切片段分析（ARDRA）、实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）以及细菌宏基因组测序技术等，为不可培养微生物的菌群结构分析提供了有力的手段[22,23]。

1.2.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 该技术是利用尿素和甲酞胺两种变性物质制成一种由低至高浓度的变性胶，双链DNA在变性物质的作用下变性，不同碱基组成的DNA双螺旋在电泳时会在不同的变性剂浓度中发生变性，导致其电泳迁移速率降低，于是DNA分子停留在凝胶中不同的位置，得以分离[5,13,27]。主要步骤：先提取样品总DNA，对16S rRNA基因进行PCR扩增，然后进行PCR-DGGE凝胶电泳，相同长度的不同的核酸序列经电泳后在聚丙稀酰胺胶上分离开来。可根据条带的位置和亮度估算原始样品中DNA的相对含量，或者通过割胶获取目的DNA条带，然后对DNA进行PCR回收后连接到T载体上，筛选阳性克隆子后再通过测序进行分析，从而推断出微生物的群落结构及相应的优势菌群[24]。王甸洪等[25]运用PCR-DGGE和16S rRNA文库相结合的方法研究了螺旋粉虱Aleurodicus dispersus体内细菌多样性和主要优势菌群结构。通过PCR-DGGE技术，在小菜蛾肠道中分离到15个优势细菌的16S rRNA序列，通过序列比对结果及系统发育分析，这些细菌序列属于3个门6个属以及3种环境中不明确样本（Uncultured bacteria）。实验结果表明，变形菌门的沙雷氏菌（Serratia）在幼虫肠道中分布最广泛，Pseudomonas和Serratia在肠道细菌数量上占优势地位[16]。同样通过这种方法对桑粒肩天牛Apriona germari不同采集时间的样品进行研究，结果表明肠道菌种类差异很大[26]。

1.2.2 16S rRNA基因技术 该技术是通过将获得的微生物16S rRNA基因的序列信息与已知菌种的16S rRNA序列进行比对，从而对未知微生物进行分类和鉴定。主要有三个步骤：首先是获得基因组DNA，接着是扩增16S rRNA基因片段，最后就是测序分析16S rRNA基因序列[27]。在对褐飞虱Nilaparvata lugens体外培养细菌类内共生菌的研究中，用普通培养基分离纯化后的菌株用菌类16S rDNA的通用引物进行PCR扩增鉴定测序结果经BLAST比对分析，发现其与粉虱科的杀雄菌属内共生菌（Arsenophonussp.）相似度达99%[28]。有研究采用16S rDNA基因文库技术和Illumina HiSeq测序技术检测了自然种群泽兰实蝇Procecidochares utilis幼虫肠道内的细菌群落及多样性。总共注释到13个门，4个纲，6个目，7个科，10个属和4个种。其中变形菌门(Proteobacteria)的细菌为优势菌，占99%；在属分类阶元上，沃尔巴克氏体属（Wolbachia）占45%，是优势属[29]。分离于小菜蛾肠道的80株可培养细菌的16S rDNA基因片段经测序，可初步确定细菌主要分布在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)，黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)等五个科。所占比例达到76.25%，是肠道可培养微生物最优势菌群[30]。

1.2.3 分子杂交技术 该技术是利用待检测样品的16S rRNA基因和特定已知序列分子探针进行杂交，以确定样品中微生物群落组成及丰度。主要方法包括：芯片杂交、荧光原位杂交以及原位杂交等[22]。其基本的操作步骤：先对序列进行排队，序列特异性鉴定，然后互补核酸探针的合成和标记，最后进行探针特异性和测定敏感性评价和优化[31]。采用基因芯片技术研究人类致病菌疟原虫Plasmodium falciparum携带者冈比亚按蚊Anopheles gambiae的肠道菌区系组成及肠道细菌与疟原虫P.falciparum之间的关系，结果表明肠道微生物能够通过调节A.gambiae的某些免疫基因对抗疟原虫的感染[32]。采用荧光原位杂交技术，研究臭椿Parastnachia japonensi肠道共生菌时，发现P.japonensis体内存在一种ɤ-变形菌纲细菌的专性共生菌，并且P.japonensis中肠后端有一个特化的结构，共生菌专性栖居在该共生体器官内[33]。

1.2.4 限制性片段长度多态性（RFLP） 该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，不同种群的生物个体DNA序列存在差别，因此可检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。基本步骤：首先扩增一基因或基因片段，然后用限制性内切酶酶切该扩增片段,最后通过电泳酶切片段以区分[24,34]。通过该技术已经对昆虫肠道(包括金龟子肠道、白蚁肠道等)等生境中的微生物群落组成和多样性进行了一定的研究[35,36]。用该方法对桑粒肩天牛肠道微生物的16S rDNA扩增片段分析建立的传统克隆文库，根据不同的酶切指纹图谱将175个克隆子归为48个不同的分类操作单元(OTUs)。通过各选一个分类操作单元，作为一个代表克隆子进行测序比对，可知这48个OTUs分属于22个不同的细菌属，其中优势菌分属于肠球菌属(Entorococcus)，乳球菌属(Lactococcus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)，分别占所检测克隆总数的17.1%，19.4%和24.6%[26]。利用细菌的16S rRNA-RFLP方法分析柏大蚜Cinara tujafilina和松大蚜C.pinitabulaeformis的结果表明：其体内细菌组成主要是初级内共生菌Buchnera aphidicola和次级内共生菌Candidatus Serratia symbiotica，并且分别所占的比例也有差异。在柏大蚜中，B.aphidicola占37%，C.Serratia symbiotica占56%，还有少量的肠杆菌属Enterobacter占7%；在松大蚜中，B.aphidicola占66.7%，C.Serratia symbiotica占33.3%[23]。

1.2.5 实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR） 该技术是根据样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，且反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，通过荧光量的检测来测定样本核酸量[40]。主要步骤是将荧光报告基团和荧光淬灭基团放到PCR反应体系中，利用荧光信号的变化来实时监控PCR的进程，然后通过其绘制的标准曲线对未知模板进行定量分析[27,38,39]。杨义婷[40]运用实时荧光定量PCR等技术方法，检测不同发育历期的烟粉虱Bemisia tabaci体内的R.bellii菌的拷贝数变化，发现在烟粉虱发育过程中，R.bellii菌的拷贝数会在羽化初期发生显著性增长，随后下降，但第六天又开始发生显著上升趋势，从而明确了优势种菌在烟粉虱发育历期、产卵量、存活率、抱卵量和后代性比等方面的影响。此技术也应用于昆虫检疫及昆虫的分类鉴定等方面的研究，例如B型烟粉虱的鉴定[41]。

1.2.6 扩增性核糖体DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)该技术主要作用于核糖体DNA序列，不同物种rDNA序列不尽相同，使用相同限制性内切酶对其进行酶切，则会产生不同数量、不同长度的片段，从而将不同微生物区别开来[22]。基本步骤：采用特异限制性内切酶对一定长度的DNA片段进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测，从而分析微生物的多样性[42]。采用ARDRA技术研究暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫肠道内可培养纤维素分解菌的多样性，结果可将分离得到的207株菌株归为21种不同的类型[43]。从思茅松毛虫Dendrolimu kikuchii4龄幼虫肠道环境中分离、纯化、培养，可获得11株好氧细菌的菌株，以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行ARDRA多态性分析，在84%的相似水平上可分成6大类群，多样性丰富[44]。

1.2.7 宏基因组测序技术 该技术是对于一些不可以培养微生物的群落结构和功能进行研究的新技术[40,45]。基本步骤是通过高通量测序与分析，对微生物种群的DNA片段进行拼接重组，并与公布数据库中其他菌类的信息比对，即可预测该菌种可能存在的功能[40]。运用宏基因组测序技术对不同生物型的豌豆蚜进行研究，鉴定出了21种共生菌，其中8种占主导地位，共生菌之间的复杂联系是导致寄主植物专化性的重要因素[46]。夏晓峰[47]测定了小菜蛾幼虫、蛹和成虫的中肠微生物宏基因组，宏基因组分析表明小菜蛾中肠微生物由变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、蓝细菌门Cyanobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、硝化螺旋菌门Nitrospirae，以及古细菌的广古菌门Euryarchaeota,真菌的担子菌门Basidiomycota和子囊菌Ascomycota组成，占整个中肠微生物的99%以上。

2 昆虫体内共生菌的研究方法在研究宿主的生理功能中的应用

昆虫内共生菌是昆虫与微生物在长期进化过程中形成的虫菌共生体系中的重要部分，对宿主的生长与发育起着非常重要的作用。昆虫体内组织为内共生菌的生存繁殖提供了理想的物质及环境条件，昆虫内共生菌主要具有调节生殖生长发育、营养平衡和抵御病原侵害等作用[4,48]。

2.1 共生菌种群变化与抗药性的关系

采用PCR-DGGE的分子生物学的技术对敏感的品系、抗高效的氯氰菊酯品系的德国小镰Blattella germanica的肠道菌进行分析，通过敏感与抗性品系的德国小镰肠道的图谱差异，电泳条带的数量和迁移率的不同，得知在外界杀虫剂的作用下能够显著的改变德国小镰的体内微生物的种类及种群数量。并且在去除肠道菌后的德国小镰幼虫的孵化数、幼虫的羽化率均会降低，所产后代的雌性个体比例下降，繁殖力与敏感品系相比呈下降的趋势，表现出繁殖不利性。肠道菌除了影响德国小镰的生殖方面，对其生长和发育也有显著的影响，去除肠道菌的德国小镰的幼虫死亡率较高，且从幼虫到成虫期间的生长的历期会有所延长[49]。

2.2 共生菌与昆虫免疫系统的互作研究

在昆虫共生细菌与病毒的关系上，有研究表明，在黑腹果蝇中Wolbachia能够提高宿主对许多病毒的抵抗能力，并且在其他昆虫中Wolbachia可能也具有类似功能[50]。利用携带共生菌的线虫侵染、钨针沾共生菌菌悬液针刺和人工饲喂共生菌这3种方法将S.nematodiphilaR187植入黑腹果蝇Drosophila melanogaster血腔或肠道；通过果蝇死亡率、细菌菌落计数，结合果蝇体液免疫信号系统调控的2种抗菌肽—Diptericin和Drosomycin表达的qPCR检测，发现H.rugaoensis携带共生菌和共生菌针刺侵染后同时激活果蝇的Toll和Imd途径；荧光定量PCR结果显示侵染过程中Diptericin和Drosomycin的相对表达均呈先上升再逐渐减弱的趋势；结果证明S.nematodiphilaR187侵染果蝇时，Toll途径和Imd途径都被激活；果蝇抵抗S.nematodiphilaR187入侵的体液免疫信号通路主要是其Imd途径；S.nematodiphilaR187可能采用免疫逃避机制从其肠道成功侵染果蝇[51]。

2.3 共生菌与昆虫营养代谢的相互关系

有研究应用PCR-DGGE技术对华山松大小蠢Dendroctonus armandi的微生态组成、不同发育阶段和雌雄成虫间真菌群落多样性动态进行研究，揭示了华山松大小蠢肠道真菌群落多样性差异，并且发现真菌群落组成中的酵母菌(假丝酵母Candida)和丝状真菌(蓝变真菌Ophiostoma）可能直接或间接帮助华山松大小蠢克服寄主树木抗性，并为其发育提供必要的营养和能量补充[20]。张来丽等[52]研究发现白蚁肠道微生物对降解木质素起着主导作用，木质素的完全降解是真菌，细菌及相应微生物群落共同作用的结果。

2.4 共生菌种群对昆虫生长发育和寿命的影响

利用16S rDNA-454焦磷酸测序技术调查了水虻各个连续生命阶段的细菌多样性，发现拟杆菌门和变形菌门最具优势的菌门；经过产卵地点选择测试（OSP）后，确定起关键作用的是一个细菌复合体（BSF-4），其中有4株菌，对水虻产卵都具有吸引作用；通过对虫卵进行处理获得无菌幼虫，之后测定在喂食相同无菌人工饲料条件下无菌幼虫与正常幼虫生活史特性的差异。结果显示，无菌幼虫预蛹率和存活到成虫阶段的比率均显著低于正常幼虫[53]。采用PCR-DEEG和超级PCR等技术对地中海实蝇（Ceratitis capitata）肠道菌群的研究发现，在实验室条件下接种高水平绿脓杆菌会减少地中海实蝇寿命，而接种肠杆菌科却能增加地中海实蝇寿命[54]。

3 结语与展望

研究表明，内共生菌可为宿主提供食物中缺乏的必需营养物质，并协助消化食物和解毒[7,55,56,57]，许多微生物含有多种酶系统，可通过协助宿主的营养代谢，提供食物中缺乏的营养物质，并弥补食物中营养物质的不足；以及分泌抗菌肽、毒素等物质来增强宿主昆虫自身防御病原微生物和寄生物的能力[58,59,60,61]。同时，也可以调控植物生理反应，增强宿主的抗逆性，抑制植物对宿主的不利影响，也可以通过对抗逆性基因的精确表达调控来增强宿主抗药性等[7,45]。昆虫的生理活动与体内共生微生物或肠道微生物之间有着密切的联系，在探索昆虫微生物及共生微生物的功能研究中，分析微生物的生物群落及多样性必不可少，选择合适的分析昆虫微生物群落的方法就尤为重要。

本部分将对文中提到的各种方法的优缺点进行比较（附表1），并对各方法的适用条件进行概述。对于传统培养技术无法培养和检出的细菌，可以利用基于16S rRNA序列的分子生物技术。16S rRNA基因分析技术是微生物多样性究中最先使用的方法之一，在微生物的分类鉴定研究中发挥了重要的作用[22]。原核生物中的16S rRNA序列具有高度的保守性，在分子生物的角度看来，适用于分析属及属以上水平的菌株[27]。PCR-DGGE技术是根据PCR产物序列的特异性的熔解温度来进行分离的，只要条件合适且操作精确，可以检测出具有一个核苷酸差异的DNA分子[13]。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。该方法可以同一时间检测多个样品以及区别群落中的处于优势的种类，对于了解种群时空变化是较好的方法，另外也可用来分析鉴定群落组成[27]。基于16S rRNA基因的DGGE技术已被广泛应用于分析昆虫肠道微生物多样性。实时荧光定量PCR技术以其具备定量精准、简易高效、特异灵敏等优点成为了分子生物学研究的重要工具，目前已广泛应用于基础生物学研究、食品检测、环境检测、医学检测与诊断等研究之中[39,62]。分子杂交技术广泛应用于微生物群落组成研究中，有人曾采用16S rRNA基因探针芯片对水、土壤以及气溶胶样品中的微生物组成进行了研究，检测出的微生物种类明显多于传统的研究方法检测到的微生物种类[63]。利用PCR-RFLP分析细菌16S rRNA基因，一般可将其鉴定到种及亚种的水平[34]。ARDRA技术主要作用于核糖体DNA序列，能较好反映种间多样性，适合种级水平区分，己被广泛地用于环境微生物多样性、生物群落结构和系统发育关系的研究[42,64]。近年来，不断发展起来的宏基因组测序技术，能够解决实际工作中的许多问题。宏基因组是指某一生境中全部微小生物遗传物质的总和，主要指细菌和真菌的基因组总和[48]。复杂生境中的可培养及不可培养微生物种类及基因信息都可通过该技术被了解[22]。分子生物学技术能够更客观的反应微生物的种类，也更适合于对生殖道微生物种类和肠道微生物群落等复杂系统的种群结构及多样性的分析[6]。当然也可通过结合多种方法进行比较研究，从而更准确地反映昆虫微生物的多样性[8,65]。目前常采用传统培养与分子生物学方法相结合的研究方式，来提高研究结果的可靠性。

由于测序技术的快速发展，现在的研究方法比较倾向于采用基因组测序，这样能够大大降低传统培养和相关分子技术本身的一些缺陷，从而能更真实的反应昆虫和环境微生物的种类与数量[24]。在实际工作中，可根据检测的材料、检测的目标和所拥有的基础条件设施来选择使用合适的研究方法。目前，利用宏基因组技术对昆虫共生菌功能的研究报道还较少，因此，今后的研究方向可尝试用宏基因组技术来分析昆虫共生微生物的功能，完善昆虫微生物的研究技术，为解释昆虫微生物与宿主营养代谢、免疫防御、抗药性、生长发育、环境适应等方面的互作关系提供新思路。

附表1利用各分子生物学方法进行微生物鉴定的优缺点Table 1 The advantages and disadvantages of various molecular biology methods to identify the microorganisms