‘红宝石无核’与玫瑰香型葡萄杂交胚挽救技术研究

田淑芬，月丫,2，张娜，郭艳芳,2

（1. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

目前我国葡萄的育种方向是经济性（早熟、抗病、耐贮存）与食用性（大粒、香气浓、无核、色泽鲜艳）并重的优良无核葡萄新品种[1-2]。将无核与玫瑰香味两种性状相结合培育无核且具有玫瑰香味的葡萄品种市场前景广阔。胚挽救技术为当前无核葡萄育种的主要方法，研究无核葡萄胚挽救中影响幼胚生长发育的因素对培育无核葡萄新品种具有重要指导意义[3-5]。本研究以种子败育型无核品种‘红宝石无核’做母本，以二倍体‘玫瑰香’优系和四倍体‘巨玫瑰’作父本进行三倍体无核葡萄胚挽救研究[6-7]。研究旨在解决影响无核葡萄离体培养的培养条件，以提高无核葡萄幼胚的萌发成苗率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究开始于2017年4月，2018年6月结束。研究地点为天津市农业科学院葡萄研究中心武清试验基地和天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室。研究材料均取自天津市农业科学院葡萄研究中心武清试验基地葡萄园。供试材料为‘红宝石无核’‘玫瑰香’和‘巨玫瑰’葡萄。杂交组合设计（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 田间杂交

本研究于2017年5月开始葡萄花粉的采集工作。在父本葡萄花穗有5%左右的小花开放时，采集花粉，晒干，放在装有干燥剂（变色硅胶）的瓶中，标记好相应的品种名称，保存于4 ℃冰箱中备用[8-9]。在无核红宝石葡萄开花前1～3 d进行人工去雄，第2天开始对试验花穗进行授粉的工作，连续授粉3 d，每天2次。去雄完成以及每次授粉完成后要立即套袋，在杂交花穗上标注好授粉时间和杂交组合名称。每组杂交授粉15穗。

1.2.2 幼果采集

杂交胚珠的取样工作开始于2017年6月，在从最后一次授粉完成以后的30 d开始。每7 d为一个取样周期，共采摘3次，每次300粒。将幼果采下后带到实验室进行清洗消毒工作，基本操作如下：首先进行清洗处理，剪去果柄的幼果用自来水冲洗数次[10-11]，流水冲洗10 min。然后再进行消毒工作，将清洗后的幼果放置在超净工作台上，先用75%酒精冲洗幼果一次，之后用无菌水冲洗3次，再将其放入次氯酸钠溶液中浸泡3 min，最后再用无菌水冲洗3次。

1.2.3 胚发育阶段胚珠培养

在无菌环境下，用解剖针将幼果中的胚珠剥离出来，将剥取的胚珠接种在培养基中，置于培养室内，温度25～28 ℃，相对湿度45%～60%，pH＝5.8。发育培养基为：E1，ER＋1.5 mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3＋60 g/L蔗糖＋5 g/L琼脂＋1 g/L活性炭；N1，Nitsch＋1.5 mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3＋60 g/L蔗糖＋5 g/L琼脂＋1 g/L活性炭。

1.2.4 胚萌发阶段胚培养

接种在发育培养基中的胚珠，经过60d的培养以后，在超净工作台中将其取出（保证无菌环境），进行剥胚工作，从而进入胚萌发阶段[12]，30 d后进行调查。萌发培养基为：M1，1/2MS＋0.1 mg/L IBA＋30 g/L蔗糖＋5 g/L琼脂＋1.5 g/L 活性炭；W1，WPM＋0.2 mg/L 6-BA＋30 g/L蔗糖＋5 g/L琼脂＋1.5 g/L 活性炭，pH＝5.8。

1.3 数据统计与处理

胚珠在发育阶段经过60 d后对其胚发育率进行计算统计，胚在萌发阶段经过30 d后对其胚萌发率进行计算统计[13-14]。

胚发育率/%＝（发育胚数/接种胚珠数）×100

胚萌发率/%＝（萌发胚数/接种胚珠数）×100

表1 葡萄杂交组合设计Table 1 The hybridization crosses of grapes

2 结果与分析

2.1 不同父本对幼胚生长发育的影响

将杂交组合‘红宝石无核’ב玫瑰香’‘红宝石无核’ב巨玫瑰’的杂交胚珠接种ER培养基上进行培养，研究不同父本对胚发育的影响。

表2的数据体现出不同杂交组合经过胚珠发育培养阶段和60 d的胚珠萌发培养阶段，其胚发育率和胚萌发率有一定的差异。从表2中可以看出，杂交组合‘红宝石无核’ב玫瑰香’的胚发育率和胚萌发率比杂交组合‘红宝石无核’ב巨玫瑰’的胚发育率相对较高。两种组合的胚发育率分别为9.47%和7.51%，胚萌发率分别为6.55%和2.95%。本研究说明，当‘红宝石无核’葡萄作母本，用‘玫瑰香’做父本比‘巨玫瑰’做父本进行胚挽救更容易成功。

2.2 不同发育培养基对幼胚发育的影响

从表3数据可以了解到，经过在不同的发育培养基中培养的胚珠，其胚发育率有所不同。‘红宝石无核’ב玫瑰香’在发育培养基Nitsch和ER培养基中的胚发育率分别为13.61%和7.51%。而‘红宝石无核’ב巨玫瑰’在发育培养基Nitsch和ER培养基中的胚发育率分别为5.92%和2.95%。说明Nitsch培养基比ER培养基更适合2种杂交胚珠的发育。

2.3 不同萌发培养基对幼胚萌发的影响

由表4中的数据可以看出，杂交组合‘红宝石无核’ב玫瑰香’在不同萌发培养基中经过60 d的萌发培养阶段，‘红宝石无核’ב玫瑰香’杂交胚接种在1/2MS胚萌发培养基中的胚萌发率要高于接种在WPM萌发培养基中萌发率。但是，用这两种培养基作为萌发培养基，其胚萌发率没有特别大的差异，由此可以看出1/2MS和WPM都可以作为杂交组合‘红宝石无核’ב玫瑰香’的萌发培养基，但是1/2MS作为‘红宝石无核’ב玫瑰香’的萌发培养基更好。

3 讨论与结论

无核葡萄胚挽救的成功与否，主要影响因素是材料的母本基因型。本试验是以‘红宝石无核’品种作为母本，‘玫瑰香’优系和‘巨玫瑰’作为父本探究不同父本基因型对无核葡萄胚挽救的影响，以‘玫瑰香’为父本的胚发育率和胚萌发率比以‘巨玫瑰’为父本的胚发育率和萌发率相对较高。也就是二倍体间的杂交组合的成功率要高于二倍体与四倍体的杂交组合，说明葡萄的倍性不同相互杂交时有非常严重的杂交障碍，所以导致用二倍体×四倍体葡萄杂交很难获得杂交植株后代。这也是‘红宝石无核’ב巨玫瑰’葡萄的杂交组合胚挽救不容易成功的主要原因[11]。通过对不同发育培养基对幼胚发育的影响研究，本试验得出的结论是：‘红宝石无核’ב玫瑰香’在发育培养基Nitsch和ER培养基中的胚发育率分别为13.61%和7.51%。而‘红宝石无核’ב巨玫瑰’在发育培养基Nitsch和ER培养基中的胚发育率分别为5.92%和2.95%。说明Nitsch培养基比ER培养基更适合2种杂交胚珠的发育。对杂交组合‘红宝石无核’ב玫瑰香’在不同萌发培养基中经过60 d的萌发培养认为，本组合杂交胚接种在1/2MS萌发培养基中的胚萌发率要高于接种在WPM萌发培养基中萌发率，1/2MS作为‘红宝石无核’ב玫瑰香’的萌发培养基更好。

表2 不同亲本基因型下幼胚的生长发育状况Table 2 Growth and development of immature embryos from different parental genotypes

表3 不同培养基对胚珠发育的影响Table 3 Effect of different media on ovule development

表4 不同萌发培养基对胚萌发的影响Table 4 Effect of different germination medium on embryo germination