IL-22在扁平苔藓中的表达

朱珊珊 王蕴龙 庞传超

白介素-22(Interleukin，IL-22)是最近几年新发现的一种CD4+Th细胞因子，由Th17和Th22为主的免疫细胞分泌产生，主要生物学功能为微生物防御、保护和修复组织损伤及急性期反应，IL-22虽由这些细胞产生，却不作用于它们，在皮肤主要特征性的作用于角质形成细胞，其独特的免疫介导形式使其在很多炎症性、自身免疫性、肿瘤性皮肤病中发挥重要作用。扁平苔藓是一种临床上比较常见的累及皮肤黏膜的瘙痒性慢性炎症性疾病，病因尚未完全明确，可能是由遗传、感染、药物、自身免疫、慢性病灶、精神神经、内分泌与代谢障碍等相互作用导致的[1]，多数支持多因素影响的T细胞介导的针对基底细胞的免疫反应。目前关于IL-22在扁平苔藓中的作用研究较少，本文研究IL-22在扁平苔藓皮损中的表达，并以正常皮肤作为对照，以探讨其在疾病中的可能意义，为扁平苔藓的诊断和治疗开辟新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 实验组30例：为2016年1～11月在吉林大学第二医院皮肤科经临床和病理检查确诊为扁平苔藓患者的病变皮肤，其中男18例，女12例，年龄为19～63岁，平均年龄(42.3±8.4)岁。所有实验组病变的特点是具有相似程度的炎症反应，且无本病以外的糖尿病、高血压、感染性和过敏性疾病或其他自身免疫性疾病，如银屑病、类风湿关节炎、红斑狼疮等，且近3个月未系统或局部应用免疫抑制剂、糖皮质激素、抗生素等药物。对照组10例为2016年1～11月在吉林大学第二医院皮肤外科手术切除的正常皮肤，其中男5例，女5例，年龄为22～66岁，平均年龄(45.6±7.3)岁。所有对照组均无免疫系统疾病，无皮肤感染，两组对象年龄、性别相匹配。

1.2 主要试剂 兔抗人IL-22多克隆抗体、兔抗体免疫组化试剂盒、DAB显色液均来自北京欣博盛生物科技有限公司。柠檬酸钠抗原修复液来自碧云天生物科技有限公司。

1.3 免疫组化检测 将切除的组织标本放入4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋备用，将包埋的组织切片4 μM厚度，用于HE和免疫组化染色观察。免疫组化染色(SABC法)按照欣博盛提供的兔抗体免疫组化试剂盒的说明进行，遵循每批染色以已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判定 以细胞质中棕黄色颗粒状染色为阳性标准，由2位具有独立判断能力的医师采用双盲法对实验结果进行判定。在光镜下计数，40×10倍视野下，于每个组织片内随机选取5个视野，用5 mm×5 mm网格目镜微尺分别计算阳性细胞数及观察的细胞总数，取其平均值，计算阳性细胞数占细胞总数的百分率，根据染色强度以及着色范围进行半定量评分，结果分析方法根据Shimizu[2]法改良而成。染色强度用0～3级评分:0分为无染色，1分为轻度染色，2分为中度染色，3分为强染色；着色范围采用阳性细胞数占细胞总数的百分率计分，用0～3级评分：<20%为0分，20%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。以上两项相加为着色程度积分，表示IL-22在皮损中的表达强弱，结果:0、1分为阴性(-)；2分为弱阳性(+)；3～4分为阳性(++)；5～6分为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法 用SPSS 17.0统计软件处理数据，采用两等级资料比较的Mann-Whitney U秩和检验进行相关分析，结果以P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有统计学显著性差异。

2 结果

2.1 HE染色结果 见图1。

2.2 免疫组化染色结果 见图2、3，表1。在30例实验组中，IL-22主要表达于扁平苔藓表皮全层的角质形成细胞和真皮浅层浸润的淋巴细胞胞质中，呈棕黄色颗粒。其中16例为强阳性，8例为阳性，4例为弱阳性，2例为阴性。在10例对照组中，IL-22也表达于正常皮肤组织，主要定位于基底层附近的角质形成细胞中，呈淡黄色颗粒。其中1例为强阳性，2例为阳性，4例为弱阳性，3例为阴性。由表1可看出，IL-22在扁平苔藓皮损中的表达水平明显高于在正常皮肤组织中的表达水平，二者差异经统计学分析具有显著统计学意义(P<0.01)。

图1 a:表皮角化过度，颗粒层楔形增厚，棘层不规则增厚;b:基底细胞液化变性，真皮浅层致密淋巴细胞带状浸润(a HE，×100；b HE，×200)

图2 IL-22在扁平苔藓中的表达(2a,2c SABC，×100；2b,2d SABC，×400)

图3 IL-22在正常皮肤中的表达(3a SABC×100；3b SABC×400)

表1 IL-22在扁平苔藓和正常皮肤组织中的表达

注：采用Mann-Whitney U test，P<0.01为有显著性统计学差异

3 讨论

扁平苔藓是一种临床上比较常见的特发性炎症性疾病，占皮肤科所有就诊患者的0.5%以上[3]，皮损部位不一，可同时或先后累及一个或多个区域，皮肤和口腔黏膜是最常受累的部位。目前认为免疫机制和角质形成细胞障碍活化介导了扁平苔藓的发生，但确切的发病机制尚不清楚，IL-22是一种新型细胞因子，它在外周组织损伤期间介导着免疫细胞向上皮细胞间信号的传递，引起上皮细胞产生抗菌蛋白和炎症介质。IL-22具有两种结合受体--膜性受体(IL-22R)和可溶性受体(IL-22RA2)，膜性受体是由IL-22R1与IL-10R2构成的异源二聚体受体复合物，因细胞因子对IL-22R1具有很高的亲和力，该受体的表达也决定了组织细胞对IL-22的反应性。IL-22R1的分布具有一定的组织特异性，主要表达于皮肤、肾脏、胰腺、肺脏等的实质细胞，特别是在角质形成细胞和胰腺，而在NK和单核等免疫细胞中不表达[4]。IL-22RA2是一种天然的蛋白性抑制剂，能竞争性结合IL-22并阻断其生物学活性[5]，进而干预细胞因子下游的信号传导。IL-22作用于角质形成细胞，诱导其产生抗炎因子或保护蛋白，如IL-11、卵泡抑素、β-防御素、钙结合蛋白A7、A8、A9等，重塑伤口愈合，发挥固有防御机制，防止皮肤感染。另外，IL-22可以下调终末期角质形成细胞分化基因，抑制其分化产物的表达，促进细胞增殖，提高细胞向远处迁移的能力[6]。除此之外，IL-22还能诱导多种炎症介质的表达，即IL-6和趋化因子(CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8)[7]，诱导皮肤显著增生和炎症反应。目前人类中IL-22主要由活化的Th22、Th1、Th17细胞产生[8]，这些细胞已被证实在感染性、免疫性疾病的发生发展中均发挥着广泛的生物活性，提示IL-22升高存在于T细胞介导的慢性炎症性疾病如银屑病、扁平苔藓中。本文试验发现在扁平苔藓皮损部位，IL-22表达水平较正常人皮肤明显增高(P<0.01)，提示IL-22参与了扁平苔藓皮损的形成。

既往的研究表明，扁平苔藓的特征在于针对上皮细胞的T细胞介导的免疫应答，引起表皮细胞损伤和真皮浅层T淋巴细胞浸润，产生其特征性的的病理改变和临床表现。与扁平苔藓发病机制相关的细胞主要有CD4+T、CD8+T、树突状细胞、角质形成细胞，其中效应性CD4+T细胞即辅助性T细胞及其分泌的细胞因子参与了扁平苔藓发病的各个方面。IL-22在扁平苔藓皮损中表达明显增多，同样提示Th17、Th22细胞免疫参与其致病过程，这与以往的报道一致。当皮肤收到各种因素刺激时，CD4+T细胞激活，CD8+T细胞活化，将被处理过的内源性或外源性抗原信息呈递给T细胞，释放TNF-α、IL-22等因子。我们大胆的猜测，IL-22与受体结合后，诱导细胞内多种信号激活，进一步活化下游信号传导通路，包括JAK/STAT通路(Jak1、Tyk2、STAT3)和MAPK通路(p38MAPK、JNK、EPKl/2)，启动下游靶基因的表达，促进角质形成细胞增殖、抑制其凋亡和分化，诱导其产生调节防御机制的细胞因子、抗微生物肽，加强皮肤防御功能。过度表达的IL-22可能需要达到一个阈值才能引起炎症反应，使激活的STAT3持续磷酸化，表达一系列基因产物，如Caspases、bcl-2、生存素、p53、p63，分泌血管内皮细胞生长因子等，Caspases、bcl-2、p53均为细胞凋亡标志物，激活后引起细胞凋亡，即出现凋亡小体，导致同时基底细胞液化变性，淋巴细胞凋亡缺失或减弱，可能也是炎症细胞持续浸润的一个原因[9]。除此之外，通过MAPK途径激活的p38参与激活促炎分子、趋化因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等表达，亦可与TNF-α协同作用促进CSF、IL-8的释放，诱导炎性细胞向炎症部位游走，放大炎症效应，形成真皮浅层T细胞带状浸润，促进细胞凋亡与基底细胞液化变性。浸润细胞继续分泌TNF-α、IL-TIF等细胞因子，致使病情反复，病程延长。那么当IL-22在皮损区异常表达时也就可能造成扁平苔藓特征性皮损和病理改变。本研究发现，在大多数正常表皮中也有IL-22的表达，且多位于表皮基底层，考虑可能与IL-22的正向作用相关，适量表达的IL-22可以下调终末期角质形成细胞分化基因，促进正常表皮中细胞增殖、分化，而当其过量表达时则造成皮肤显著增生和炎症反应等现象。IL-22在不同疾病、不同组织中扮演双刃剑的角色，考虑可能与该细胞因子的数量、持续时间、所处环境及浸润的炎性细胞种类等因素有关。

近年来，越来越多的学者开始研究IL-22在扁平苔藓发病机制中的作用，但目前这些研究还不成熟，仅是初步的。Domingues等[10]对外周血单核细胞进行流式细胞仪检测时发现，CD8+T细胞通过激活TLR7/8或SEB引起IL-22+T细胞(TC22、Th22细胞)数量频繁增加，并能在LP患者中检测到，这些增加可能导致IL-22分泌T细胞向皮肤或黏膜炎症部位迁移。本次研究主要选取的对象是皮肤型扁平苔藓皮损，目前国内外学者对白介素在扁平苔藓中的研究多集中于口腔型，Shen等[11]通过RT-qPCR和Western blot分析检测IL-22和靶向微小RNA的表达时进一步证实IL-22在口腔扁平苔藓中高表达。而Chen等[12]、Weber等[13]研究时发现IL-22在口腔扁平苔藓的表达高于皮肤型，有明显的特异性。

扁平苔藓皮损中T细胞的异常活化及其所产生的多种细胞因子的异常表达引发了疾病的发生，但机体通过释放更多的因子来调节自身的免疫平衡。在本研究中，我们探讨了IL-22在扁平苔藓中的表达情况，结果提示IL-22在疾病发病中可能具有一定作用。本研究并未证实IL-22的表达与疾病严重程度是否呈相关性，需要血清学检查及跟踪患者预后等进一步观察研究。此外，扁平苔藓的发病过程受多因素影响，我们的实验在取材和研究方法等诸多方面存在一定局限性，希望经过我们的研究为深入揭示扁平苔藓发病机制提供理论依据，为疾病的治疗及预后提供新的靶点。