斑翅果蝇Orco基因的生物信息学分析

向候君, 蔡普默, 张贺贺, 王 波, 季清娥, 陈家骅(1.福建农林大学益虫研究所；2.联合国(中国)实蝇防控研究中心，福建 福州 350002)

斑翅果蝇[Drosophilasuzukii(Matsumura, 1931)]又称樱桃果蝇、铃木氏果蝇，英文名称是spotted wing drosophila (SWD)，属于双翅目(Diptera)环裂亚目(Cyclorrhapha)果蝇科(Drosophilidae)果蝇属(Drosophila)水果果蝇亚属(Sophophora)黑腹果蝇种组[1-5].斑翅果蝇广泛分布于世界寒带、温带、亚热带和热带地区[6].其寄主植物广泛，已知寄主涉及18个科60多种水果.该果蝇雌虫的产卵器为坚硬的锯齿状，可将卵直接产于成熟或即将成熟的樱桃、桃、欧洲李、葡萄、草莓、树莓、蓝莓、柿子、番茄等软皮果实内，幼虫在果实内取食，给果园造成严重损失[3].目前对该虫的治理以化学防治为主，但由于斑翅果蝇的卵、幼虫和蛹长时间隐蔽在果实内部，仅成虫暴露在空气中，使得化学防治效果欠佳，且易产生“3R”等一系列环境问题.因此，对斑翅果蝇进行生物防治是未来综合治理的主要发展方向[5,7].

嗅觉受体最初从黑腹果蝇(D.melanogaster)中鉴定出来，被命为Or83b[8].此后从不同昆虫中鉴定出的Or83b的同源受体，分别被委以不同的名称，如地中海实蝇Ceratitiscapitata(Wiedemann)的嗅觉受体为CcOr83b[9].特异的传统嗅觉受体(olfactory receptor, OR)与高度保守的非典型嗅觉受体(olfactory receptor coreceptor, Orco)共同形成异源二聚体配体门控阳离子通道，对昆虫嗅觉具有至关重要的作用[10].Orco的主要功能是将传统气味受体运送至嗅觉神经元树突膜的表面，同时维持嗅觉受体复合体的构象稳定.该受体基因的突变可以导致昆虫嗅觉功能的严重缺失[11].气味受体将环境中小分子化学信息物质所携带的信息转化为电信号，导致嗅觉神经元产生动作电位，使昆虫感知到外界气味进而做出相应的行为反应[12].Orco序列上的高度保守性以及在嗅觉识别中的独特地位，暗示Orco可能成为破坏嗅觉信号的一个潜在靶标，对嗅觉的有效干扰或破坏，将严重影响昆虫对气味和性信息素的反应，进而影响到昆虫的取食、交配和产卵等重要生命行为活动[10].

Sukanya et al[13]对斑翅果蝇化学生态适应性与果蝇嗅觉基因家族进化的相互关系做了初步研究，但未见有关斑翅果蝇嗅觉受体基因的研究.本研究对斑翅果蝇Orco基因的生物信息学进行分析，为进一步研究和验证斑翅果蝇Orco基因在嗅觉上的功能提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 序列来源

斑翅果蝇Orco基因序列来源于NCBI的Genbank数据库(登录号:NM_001328601).

1.2 研究方法

采用ExPASy数据库提供的ProtParam(http:∥web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)工具在线预测斑翅果蝇Orco蛋白的理化性质；亚细胞定位分析采用TargetP 1.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)软件；跨膜区预测采用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)程序;信号肽分析运用SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线工具；磷酸化位点分析利用NetPhos 3.1软件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；采用Smart(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在线软件分析预测蛋白保守结构域;蛋白亲疏水性利用ExPASy的Protscale(http:∥web.expasy.org/protscale/)分析；采用Protfun 2.2软件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在线分析预测蛋白功能；二级结构采用SOPMA软件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析;三级结构使用Phyre2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/190d03ee9c33015a/summary.html#multi)蛋白质折叠识别预测分析；氨基酸序列同源性分析采用BLASTt、MAGE 5.2软件.

2 结果与分析

2.1 斑翅果蝇Orco蛋白理化性质

运用ProtParam工具对Dsuz/Orco蛋白的理化性质进行预测表明，Orco基因编码486个氨基酸，分子质量为54 271.14 u，等电点为8.69.在组成Orco蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸的含量最多，占10.3%，不稳定系数为32.00，属不稳定蛋白；Orco蛋白带负电荷氨基酸残基数为31个，带正电荷氨基酸残基数为37个；脂肪系数为90.91，总平均亲水指数为0.252，整条多肽链表现为疏水性，推测斑翅果蝇Orco蛋白为脂溶性蛋白.

2.2 斑翅果蝇Orco蛋白亚细胞定位

运用TargetP 1.1软件对蛋白亚细胞定位结果见表1.最终预测的分数(Loc)，并不是真正的概率，表示分数最高的位置最有可能.从结果可知，目的蛋白Orco的分泌途径为其他型(除mTP、SP、其他位置外)，即并不是定位在细胞核，而是定位在其他细胞器.

表1 斑翅果蝇Orco蛋白亚细胞定位结果Table 1 The subcellular localization of Orco protein in Drosophila suzukii

2.3 斑翅果蝇Orco蛋白跨膜区预测

利用TMHMM-2.0和SMART分析均显示Orco蛋白共有7个跨膜结构，分别在第44～66位、第79～96位、第135～157位、第193～215位、第347～369位、第389～411位、第460～482位氨基酸的位置处各有一个跨膜结构(图1).其中,第1～43位、第97～134 位、第216～346位、第412～459位氨基酸在膜内，第67～78位、第158～192位、第370～388位、第483～486位氨基酸在膜外.

图1 斑翅果蝇Orco蛋白跨膜结构Fig.1 The transmembranc structure of Orco protein in Drosophila suzukii

2.4 斑翅果蝇Orco蛋白信号肽预测

SignalP 4.1程序自动利用神经网络模型进行信号肽预测，并得到3种计算结果(C、Y、S值).SignalP预测结果显示，D值为0.149，小于阈值0.5，所以Orco蛋白不存在信号肽(图2).

图2 斑翅果蝇Orco蛋白信号肽预测Fig.2 Signal peptide prediction of Orco protein in Drosophila suzukii

2.5 斑翅果蝇Orco蛋白磷酸化位点

利用NetPhos 3.1软件分析斑翅果蝇Orco蛋白潜在磷酸化位点，结果表明,31个丝氨酸、17个苏氨酸和5个酪氨酸可能成为Orco蛋白激酶磷酸化的位点(图3).

2.6 斑翅果蝇Orco蛋白保守结构域

据Smart在线分析结果得知，斑翅果蝇Orco第70～476位氨基酸残基有一个Pfam 7tm_6的结构域，并且该结构域的起始位点在第70个氨基酸，终止位点位于第476个氨基酸，其E值大小为2.5e-137.

2.7 斑翅果蝇Orco蛋白亲疏水性

利用ExPASy的Protscale分析蛋白疏水性(图4)发现，该基因编码蛋白疏水性最大值为2.589(第479位)，最小值为-2.433(第277位).由此可知,该基因编码的蛋白属于疏水蛋白.

2.8 斑翅果蝇Orco蛋白功能预测及分析

从Protfun 2.2软件分析结果(表2)可知，该蛋白具有脂肪酸代谢(fattyacid metabolism)、转运和结合(transport and binding)及能量代谢(energy metabolism)的可能性分别为1.265、2.033和0.938.这说明斑翅果蝇Orco基因在脂肪酸代谢及转运和结合中发挥重要作用，同时可能对能量代谢等起着关键作用.

图3 斑翅果蝇Orco蛋白潜在磷酸化位点Fig.3 The potential phosphorylation site of Orco protein in Drosophila suzukii

图4 斑翅果蝇Orco氨基酸亲疏水性Fig.4 The hydrophilicity and hydrophobicity profile of Orco amino acids in Drosophila suzukii

表2 斑翅果蝇Orco蛋白功能预测Table 2 The function prediction of Orco protein in Drosophila suzukii

2.9 斑翅果蝇Orco蛋白二级结构

通过SOPMA软件分析(图5)可知斑翅果蝇Orco蛋白二级结构:α螺旋(alpha helix)244个，占50.21%；直链延伸(extended strand)98个，占20.16%；β转角(Beta turn)42个，占8.64%；无规则卷曲(random coil)102个，占20.99%.由此可知，斑翅果蝇Orco蛋白二级结构以α螺旋为主.

2.10 斑翅果蝇Orco蛋白三级结构

运用Phyre2软件分析预测斑翅果蝇Orco蛋白三级结构(图6)可知，该蛋白三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲缠绕折叠形成.

A.二级结构序列(h:α螺旋；e：直链延伸；t：β转角；Cc：无规则卷曲)；B.二级结构预测(蓝色为α螺旋,红色为直链延伸,绿色为β转角,紫色为无规则卷曲)；C.峰值变化图.图5 斑翅果蝇Orco蛋白二级结构Fig.5 The secondary structure of Orco protein in Drosophila suzukii

图6 斑翅果蝇Orco蛋白三级结构Fig.6 The tertiary structure of Orco protein in Drosophila suzukii

2.11 斑翅果蝇Orco蛋白氨基酸序列与其他昆虫Orco序列的进化分析

将斑翅果蝇Orco基因的氨基酸序列与橘小实蝇(Bactroceradorsalis)、地中海实蝇、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、桃蛀螟(Conogethespunctiferalis)、致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、黑腹果蝇、烟草天蛾(Manducasexta)、家蝇(Muscadomestica)、麦蛾(Sitotrogacerealella)等9种昆虫的Orco氨基酸序列进行多序列比对和分析，使用MEGA 5.2软件中的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建分子进化树(图7).其中，斑翅果蝇和黑腹果蝇聚为一支，自举置信值为100，说明两者的遗传关系极其相近，同时说明两者Orco氨基酸序列具有较高的相似性.在双翅目中，斑翅果蝇与实蝇科关系较近，与家蝇关系较远.

图7 斑翅果蝇Orco蛋白序列与其他昆虫Orco序列的进化树Fig.7 Phylogenetic tree of Orco protein in Drosophila suzukii with other insects

3 小结与讨论

本研究表明，斑翅果蝇Orco基因的mRNA全长1 461 bp，该基因编码486个氨基酸，分子质量为54 271.14 u，等电点为8.69.亚细胞定位预测斑翅果蝇Orco蛋白亚细胞可能主要分布在内质网.信号肽剪切位点的预测主要是通过S值的大小来判断该蛋白是否属于分泌蛋白，如果S均值大于0.5，则该蛋白属于分泌蛋白，反之则不属于分泌蛋白[14-15].该基因在氨基酸序列中不存在剪切位点，且S值约0.1，小于0.5，说明该蛋白不属于分泌蛋白.

蛋白保守结构域分析发现，斑翅果蝇Orco基因第70～476位氨基酸残基有一个Pfam 7tm_6的结构域.通过亲疏水性分析可知，斑翅果蝇Orco基因编码的蛋白属于疏水蛋白.进一步对该基因功能进行预测发现，该基因编码的蛋白在转运和结合及脂肪酸代谢中发挥重要作用，同时在能量代谢中起关键作用.这符合前人研究中提到的Orco本身不与气味配体结合，它与传统嗅觉受体形成异二聚体Or-Orco，促进传统嗅觉受体在神经元树突膜上的定位并维持其稳定性，增强嗅觉受体的功能[8,16].蛋白质二级结构分析发现，该蛋白主要以α螺旋为主，无规则卷曲和直链延伸也占有一定比例.氨基酸的二级结构是高级结构的基础，会对高级结构的形成产生影响[15].三级结构主要是由α螺旋和无则规卷曲缠绕折叠形成.

斑翅果蝇嗅觉受体包含7个跨膜区，跨膜方式为受体蛋白的N末端位于膜内，C末端在膜外，这种拓扑结构与其他昆虫，如绿盲蝽(Apolyguslucorum)、双委夜蛾(Athetisdissimilis)、丽蝇(Calliphoridae)、淡色库蚊(Culexpipienspallens)等的Orco蛋白[10-11,17-18]相同.Orco与传统嗅觉受体通过保守的C末端区域相互作用形成一种新型的配体门控离子通道Or-Orco复合体.进一步比对这些昆虫Orco的氨基酸序列显示，保守区并不是随机分布，而是主要分布在蛋白序列的长链上，特别是在近C端的序列几乎完全一致，属于极端保守区域，Orco与传统嗅觉受体即通过此区域相互联系[8,19].正是由于这种序列的高度一致性，即使在被研究昆虫的基因组序列未知的情况下，也可以根据同源受体的保守区设计简并引物克隆出被研究昆虫的Orco受体基因[11].同时，Orco在结构上的高度保守性预示着这类气味受体可能在不同的昆虫中有着基本相同的嗅觉功能.