1 株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的益生特性分析

周晏阳，孔雪英，吴 梅，汤 承*

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

牦牛是青藏高原山脉附近的特有畜种，是牧民赖以生存的生产与生活资料[1]。由于牦牛制品如牦牛肉干、牦牛肉酱、牦牛酸奶和奶酪等天然、绿色、风味独特的特点，受到了广大消费者的喜爱[2-3]。但牦牛制品中的食源性致病微生物问题却不容忽视。胡萍等[4]报道天祝白牦牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率为26.67%，牦牛肉干中金黄色葡萄球菌检出率为14.70%；孔雪英等[5]也在新鲜牦牛肉中检出了致病性沙门菌。肉制品与奶制品中的食源性致病微生物给牧民和消费者健康带来极大的风险。

乳酸菌普遍存在人与动物体内，是国际公认食品级安全微生物[6]。乳酸菌不仅可以改善胃肠道微生态环境，还可以刺激黏膜和全身免疫，发挥免疫调节功能，促进动物生长发育，提高肠黏膜免疫等[7-9]。FAO/WHO的标准认定益生菌筛选必须满足3 个基本特点：耐受胃肠黏膜的选择环境；黏附宿主的肠壁细胞；分泌物或者分解产物为抗菌物质[10]。微生态制剂在反刍动物养殖尤其是养牛生产中的应用还处于刚刚起步的阶段，但专门针对牦牛的微生态制剂和食品添加剂还处于研究阶段，并没有商品化的产品[11-13]。本实验通过评价牦牛源产细菌素植物乳杆菌SWUN5815的益生性能，以期为牦牛源益生菌的开发提供新的菌种资源，为进一步开发牦牛专用的微生态制剂以及食品添加剂提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌SWUN5815以及牦牛源大肠杆菌、牦牛源沙门菌、牦牛源金黄色葡萄球菌、牦牛源芽孢杆菌均由西南民族大学动物医学实验室鉴定保存。

MRS固体培养基、MRS肉汤培养基、营养琼脂培养基、药敏片、MH（Muller-Hinton）培养基、胰酪胨大豆肉汤培养基 杭州微生物试剂有限公司；蛋白酶K、过氧化氢酶 美国Solarbio公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂、DL 2000 DNA Marker大连宝生物公司；Caco-2细胞、胎牛血清 以色列BI公司；牛胆盐 青岛海博公司；分泌型免疫球蛋白A（SIgA）检测试剂盒 武汉华美生物科技有限公司。

雌性清洁级昆明小鼠，体质量16～18 g，购于成都达硕生物公司，饲养环境为SPF级实验动物房。

1.2 仪器与设备

DELTA 320PH酸度计、Biophotometer紫外分光光度计德国Eppendorf公司；Model 680型酶联免疫检测仪美国Bio-Rad公司；牛津杯（内径6 mm，外径8 mm，高10 mm） 上海化科实验器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化

将实验室甘油保种的SWUN5815接种到MRS固体培养基培养，传3 代确保SWUN5815活性良好。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析及系统发育树构建

按照操作说明提取SWUN5815纯化培养物的基因组DNA作为PCR模板，基于16S通用引物PCR扩增得到16S rRNA基因序列并且构建系统发育树。

1.3.3 生长曲线的测定

将充分活化的菌株传代培养后按照1%的量接入200 mL的MRS液体培养基中，37 ℃培养，于不同时间取样。每间隔2 h取1 次样，测定样本OD600nm值，并记录数据，构建生长曲线。

1.3.4 对牦牛常见腹泻病原菌抑制的测定

选取牦牛源性致病病原菌沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及牦牛胃肠道分离的芽孢杆菌等13 株菌作为指示菌，参照文献[14]测定植物乳杆菌SWUN5815细菌素的抑菌能力。

1.3.5 抗生素敏感实验

实验菌株的制备：大肠杆菌（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923）质控菌株种子液以1%接种于3 mL TSB培养基，180 r/min、37 ℃摇菌6 h；植物乳杆菌种子液以1%接种于4 mL MRS肉汤，37 ℃静置培养12 h。

用无菌棉拭子蘸取已经校正的0.5麦氏比浊浓度的SWUN5815菌液，均匀地涂布整个MH培养基表面。取药敏纸片贴于平板表面，每个平板贴4 张纸片。每个平板各设3 个平行组。用大肠杆菌（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923）作质控菌株，37 ℃培养12 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径[15]。

1.3.6 耐酸和耐胆盐实验

将植物乳杆菌菌株SWUN5815接种于MRS液体培养基，37 ℃培养16 h后。将菌液调整pH值为2.0、3.0和终质量分数为0.3%牛胆酸盐，空白对照为相同时间的菌液。37 ℃恒温培养3 h后，分别进行活菌计数。实验重复3 次，并按式（1）计算细菌存活率，即可代表菌株对酸或者胆盐的耐受性[16]。

1.3.7 SWUN5815对Caco-2细胞的黏附实验

1.3.7.1 SWUN5815菌液准备

将植物乳杆菌SWUN5815接种于新鲜的MRS液体培养基，37 ℃静置培养12 h。分别将生长至对数生长期的植物乳杆菌在5 000 r/min离心15 min。收集菌体后用无菌的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤2次，最后重悬于无菌PBS中，调节细菌的浓度为1×108CFU/mL。

1.3.7.2 荧光标记SWUN5815

将上述准备好的植物乳杆菌SWUN5815悬浮于100 mg/mL异硫氰酸荧光素中，放置37 ℃恒温培养箱暗处作用1 h，再用无菌的PBS洗涤除去未结合的异硫氰酸荧光素，然后把细菌悬浮于无菌PBS中，调节其终浓度为1×108CFU/mL。

1.3.7.3 Caco-2细胞的培养

Caco-2用无菌细胞培养瓶培养，在细胞瓶中加入含10%的热灭活胎牛血清和含100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素双抗的DEME细胞培养液，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

1.3.7.4 黏附实验

1 mL细胞培养液及1 mL荧光标记的SWUN5815混匀，以不加菌的细胞为空白对照。培养板水平置于37 ℃的CO2恒温培养箱中孵育1 h，用无菌PBS将未黏附的菌洗脱。加入0.1 mL的胰酶细胞完全脱落，加入0.4 mL完全培养液终止反应，用酶标仪测定细胞悬液的荧光强度，发射光波长为530 nm，吸收光波长为485 nm，设置3 个平行对照[17]。细菌的黏附率计算如式（2）所示：

1.3.8 SWUN5815对小鼠体质量影响的测定

经1 周的适应性饲喂后，将48 只小鼠随机分为两组，每组24 只。根据前期饲喂浓度对小鼠体质量影响的结果，确定109CFU/mL为最佳的饲喂浓度。因此，实验组小鼠灌胃饲喂0.5 mL植物乳杆菌（109CFU/mL），对照组小鼠灌服等量的MRS培养基，每天1 次，连续7 d；对照组和实验组小鼠均自由采食。在灌胃结束后的第1、7、14、21天对各组小鼠称质量，并记录结果。

1.3.9 肠黏膜SIgA分泌的测定

每7 d称质量后每组随机取3 只实验组与3 只对照组小鼠，刮取小肠黏膜加入等体积的PBS（pH 7.4）混匀，以6 000×g离心15 min，获得上清液于-20 ℃保存备用。采用双抗夹心ELISA法测定采集样本的SIgA含量，具体操作参照试剂盒使用说明书[18]。

2 结果与分析

2.1 SWUN5815株的菌落形态及细胞形态特征

图1 SWUN5815照片（A）和显微镜图（B）（×40）Fig.1 Colony morphology (A) and positive Gram-staining (B) of SWUN5815 (× 40)

如图1所示，SWUN5815在MRS固体培养基上菌落形态呈圆形，颜色呈乳白色，表面光滑湿润，显微镜下呈短杆状，无芽孢，革兰氏染色呈阳性。

2.2 SWUN5815 16S rRNA序列PCR扩增结果及系统进化树构建

按照PCR条件进行扩增，琼脂糖电泳检测结果显示SWUN5815 16S rRNA基因扩增片段大小约为1 500 bp，与预期片段大小相符（图2）。根据16S rRNA序列测序结果，将其与GenBank中不同来源的植物乳杆菌相同区段基因序列构建系统进化树。从图3可看出，11 株植物乳杆菌分为两大支，SWUN5815与绵羊和山羊源的植物乳杆菌的遗传进化关系较近。

图2 SWUN5815 16S rRNA序列PCR扩增电泳图Fig.2 Electropherogram of PCR amplif i cation products of 16S rRNA sequence from SWUN5815

图3 SWUN5815 16S rRNA系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of SWUN5815 based on its 16S rRNA sequences

2.3 SWUN5815的生长曲线

以SWUN5815的培养时间为横坐标，其OD600nm为纵坐标。如图4所示，SWUN5815菌株在0～2 h处于适应期，2～12 h为对数期，大约到12 h达到生长高峰，12～24 h为稳定期，从该曲线上可以确定该菌体的最佳收获时间是11 h。

图4 植物乳杆菌SWUN5815菌株培养时间与OD600 nm的关系Fig.4 Relationship between culture time and OD600 nm value of SWUN5815

2.4 SWUN5815对牦牛源病原菌的抑制结果

由表1可知，SWUN5815所产细菌素对牦牛源肠道菌具有广谱抑菌活性。

表1 SWUN5815对指示菌和牦牛源临床分离株抑制效果Table1 Antimicrobial spectrum of bacteriocin produced by SWUN5815

2.5 SWUN5815抗生素敏感实验结果

本实验中质控菌株大肠杆菌（ATCC25922）和金葡球菌（ATCC25923）的抗药性证明了结果的可靠性。根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B纸片扩散法检测乳酸菌对多种药物的敏感性。由表2可知，牦牛源植物乳杆菌SWUN5815对常用的9 种常用抗生素敏感。

表2 SWUN5815抗生素敏感实验结果Table2 Antibiotic susceptibility of SWUN5815

2.6 SWUN5815耐酸和耐胆盐能力

表3 SWUN5815对酸和胆盐耐受结果Table3 Acid and bile salt tolerances of SWUN5815

如表3所示，SWUN5815对pH 2.0和pH 3.0的不同生长环境表现出了不同程度的耐受性。在pH 2.0的环境下存活率为58.2%，在pH 3.0的环境下的存活率达到86.9%。SWUN5815在0.3%的牛胆酸盐存在条件下培养3 h后，其对0.3%胆盐的耐受率约为66.8%，说明其对胆盐的耐受性较好。

2.7 SWUN5815对Caco-2细胞的黏附效果

将标记好的SWUN5815与Caco-2细胞孵育结束后，计算得到SWUN5815对Caco-2细胞的黏附率为42%。

2.8 SWUN5815对小鼠体质量的影响

表4 植物乳杆菌SWUN5815对小鼠体质量的影响Table4 Effects of L. plantarum SWUN5815 on body mass of mice g

由表4可知，在灌胃7、14、21 d后5×108CFU组平均质量增加值均高于对照组。在灌胃7 d后5×108CFU组的平均体质量已经显著高于对照组（P＜0.05），灌胃21 d，5×108CFU组小鼠的体质量与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。结合饲喂不同浓度植物乳杆菌SWUN5815的各时间段内小鼠体质量的变化结果表明，植物乳杆菌SWUN5815能够显著提高小鼠体质量。

2.9 SWUN5815对小鼠小肠黏膜SIgA的影响

表5 植物乳杆菌SWUN5815对小鼠肠黏膜SIgA质量浓度的影响Table5 Effects of L. plantarum SWUN5815 on SIgA concentration in mouse intestinal mucosa at different time points ng/mL

由表5可知，5×108CFU组的植物乳杆菌SWUN5815能够极显著提高SIgA的分泌（P＜0.01）。

3 讨 论

SWUN5815对革兰氏阳性菌和阴性菌均有不同程度的抑制作用。已报道可以同时抑制革兰氏阴性菌与阳性菌的乳酸菌并不多，如植物乳杆菌ZJ317、P158d等[19-20]。这可能是由于SWUN5815分泌不同类的细菌素造成的，集中细菌素协同发挥作用。细菌素的分泌量与外界环境有很大的关系，所以抑菌实验的时候环境要很稳定。作为对人类和动物的健康有益的活益生菌，乳酸菌必须满足一些基本的要求，才能在胃肠道内存活，调节肠道微生态平衡，发挥益生作用。对于反刍动物而言，复胃消化是其重要的生理特点，小肠中高质量分数的胆盐环境也不利于益生菌的存活，一般动物的小肠内胆盐质量浓度为0.3～3.0 g/L。乳酸菌需要耐受胃肠道的选择性环境，所以胃肠道的特殊环境是筛选菌株的第一要素，这也是其能否在肠道定植发挥其益生功能的关键[21]。优秀的乳酸菌必须能够耐受胃肠道低pH值、胆盐和酶类，并且在营养学和免疫学上，可促进宿主的生长[22]。黄坚等[23]筛选的几株优秀耐久肠球菌在pH 3.0的环境下存活率最高达到84%，最低为62%，均低于SWUN5815；在0.3%的牛胆酸盐条件下存活率最高73%，最低为52%，而SWUN5815的存活率为66.8%，与其相差不大。

通过研究植物乳杆菌SWUN5815的生物学特性表明，该分离株的对数生长期长，繁殖快，平台期维持时间长，因此十分适于大量发酵生产。该菌株耐酸和耐胆盐能力突出，是其在消化道环境内适应存活的前提。SWUN5815对常见的多种抗生素均表现出敏感性，并且可以有效地抑制病原微生物的生长，显示出了其作为候选益生菌株的潜力。一些乳酸菌属的益生菌株会对某些抗生素具有抗性，这可能与其携带的相关抗性基因有关，但这些抗性可能是内源性或者天然性的，不一定具有转移性。该菌株还能表达分泌细菌素，具有很好的抗微生物活性，因此在应用时需要综合考虑它们的表型及基因型特征与益生特性的关系。

检测黏附性强弱是益生菌筛选过程中的首要指标，因为较强的肠道黏附能力能让乳酸菌在肠道停留更长的时间，是后续发挥益生效应的前提条件[24]。乳酸菌进入消化道后，需要与肠道黏液中的蛋白受体进行接触附着后才能进行定植和发挥作用，并且可以竞争性抑制病原菌与肠黏液的黏附，保护机体不受侵害[25-26]。细菌配体和特定的真核受体是细菌黏附的重要因素，因此人肠上皮样细胞Caco-2是研究益生菌或病毒在肠道中黏附情形很好的模型。其中Caco-2细胞形态和功能与正常的小肠上皮细胞非常接近，比如含有肠道上皮细胞绒毛以及相应的酶 ，因此被广泛用于细菌黏附性、免疫调节、小肠对营养物质和新药物的吸收情况等实验[27]。植物乳杆菌SWUN5815与Caco-2细胞可以很好地发生黏附，白洁等[16]研究表明植物乳杆菌的黏附率大于肠球菌、致病菌（K88）以及乳球菌，其植物乳杆菌的黏附率可以达到60%。林雪彦等[28]也报道乳酸杆菌对Caco-2有很好的黏附效果。乳酸菌为兼性厌氧菌，并且能够形成生物膜，这也更利于其在肠道内进行快速定植并发挥作用[29]。

本实验研究结果表明SWUN5815在灌胃7 d就可以显著提高小鼠的肠黏膜免疫，前面实验证明了SWUN5815具有良好的黏附性能，而乳酸菌的黏附性是决定其免疫调节活性的关键因素。SWUN5815进入到肠道后，可以黏附到肠上皮细胞，其菌体本身和代谢产物能够刺激肠黏膜免疫系统，促进SIgA的分泌。黏附性强的乳酸菌能延长与宿主细胞的相互作用时间，从而更好地增强机体的免疫应答[30]。也有可能是SWUN5815通过合成分泌细菌素、抗氧化活性酶和降胆固醇相关酶来提升动物的抗病能力[31]。

SWUN5815分离于牦牛肠道，具有种属特异性，所以更适应青藏高原的生态环境。并且其分泌的细菌素对牦牛体内常见的病原菌均有良好的抑制作用，在牦牛奶制品和肉制品加工和贮藏过程中可以有效阻止微生物的污染，所以无论作为食品添加剂或者微生态制剂SWUN5815都是十分有潜力的优良益生菌株。