眼柄切除对口虾蛄卵巢、肝胰脏和肌肉生化组分的影响

姜丽楠，闫红伟，罗明正，崔 鑫，沈旭芳，王连顺，刘海映，刘 奇

( 1.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023； 2.大连海洋大学 海洋科技与环境学院， 辽宁 大连 116000； 3.大连海洋大学，辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁 大连 116000 )

口虾蛄(Oratosquillaoratoria)是我国沿海重要的经济种类，其肉嫩味美，营养丰富，在许多国家和地区都是重要的渔业资源[1-3]。在我国，由于捕捞过度及环境恶化等因素影响，口虾蛄资源严重衰退[4-5]，市场价格日益攀升。为保护现有资源并满足日益增长的消费需求，口虾蛄人工增殖、养殖迫在眉睫[6]。而充分了解其特殊的繁殖生物学特征，是实现人工增养殖的重要基础。

目前，在口虾蛄性腺发育与人工繁育方面，国内外均开展了一系列研究工作。如口虾蛄精巢与卵巢发育分期规律已基本摸清[7-9]；分布在我国和日本的口虾蛄主要种群繁殖生物学规律也有详细报道[10-12]；在繁殖功能相关基因的克隆与表达也有初步研究[13]。20世纪80—90年代，Hamano 等[14-17]对口虾蛄产卵、孵化、幼体发育、生长及营底栖生活洞穴等情况进行了详细研究，为人工育苗和最终养成奠定了重要基础。王波等[18]首次对口虾蛄人工育苗开展探究，孙丕喜等[19]以在水泥池底放置泥沙的方法来培育口虾蛄亲体并获成功。王春琳等[20-21]利用土池进行亲虾促熟和抱卵孵化，苗种供应问题初步得到解决。此外，刘海映[22]在我国北方也基于土池育苗方法，采用生物饵料，优化现有育苗工艺，多次成功促熟雌性口虾蛄，所产苗种质量和数量进一步得到提高。以上研究极大地丰富了口虾蛄繁殖生物学的研究内涵，但在人工调控繁殖方面，依然鲜见研究。

眼柄中的X器官—窦腺复合体是甲壳动物的重要内分泌器官，分泌性腺抑制激素和高血糖激素等神经肽类物质参与调节性腺成熟。Panouse[23]首次发现切除锯齿长臂虾(Palaemonserratus)眼柄能促进卵巢发育成熟。随后研究人员对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[24]、克氏原螯虾(Proucambarusclarkii)[25]、中华绒鳌蟹(Eriocheirsinensis)[26]、远海梭子蟹(Portunuspelagicus)[27]及日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)[28]等也进行了相关研究，并再次证实眼柄切除确实可不同程度地促进甲壳动物卵巢快速发育成熟，显著提高甲壳动物人工养殖效率。研究亦表明，双侧眼柄切除对虾蟹类的摄食行为、游泳行为等诸多方面的影响要比单侧眼柄切除剧烈，且动物因机械损伤承受的痛苦更明显，故单侧眼柄切除比双侧眼柄切除具有更高的存活率，人工养殖效果也更好[29]。截至目前，有关眼柄切除对甲壳动物生长、繁殖的影响研究主要集中于十足目种类上，而对口足目研究较少。口虾蛄作为口足目中的优势种群，切除眼柄能否促进卵巢发育，以及对卵巢、肝胰脏和肌肉中生化组成的影响尚未见报道。

笔者在口虾蛄卵巢发育期切除其单侧眼柄，分析性腺指数、肝胰腺指数以及机体重要部位生化组分的变化，以了解眼柄在口虾蛄生长，发育和繁殖过程中的内分泌功能，为相关研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年4月初在口虾蛄卵巢发育期，自辽宁省大连市皮口海域采集体表光滑、附肢完整、活力强、卵巢发育周期相近并开始发育的雌性口虾蛄160尾，经低温处理后运至实验室，于循环海水水族箱内暂养。采集的口虾蛄样本体长为10.20～15.20 cm，体质量为18.24～39.98 g。经短暂升温后，水温控制在23 ℃，每日数次投喂沙蚕、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等新鲜饵料直至饱食。每日补充20%新鲜海水，饱和充气。

1.2 方法

1.2.1 单侧眼柄切除

暂养14 d后，随机挑选10尾雌性口虾蛄，解剖并分别取出卵巢、肝胰脏和肌肉组织，记录卵巢和肝胰脏质量，分别放入样本袋中于-80 ℃冰箱保存待用。然后再随机选取雌虾80尾，采用镊烫法切除右侧眼柄，作为试验组。同时去除暂养过程中的死亡个体和活力不强个体，剩余60尾雌虾蛄作对照组。养殖条件与暂养条件一致。试验开始后分别在第5、10、15、20 d和25 d，每次采集试验组与对照组口虾蛄各10尾，样品处理方法与上述相同，所有个体均解剖出卵巢、肝胰脏和肌肉组织，分别放入样本袋中于冰箱-80 ℃保存待用。

1.2.2 性腺指数和肝胰腺指数

利用下列公式计算雌性口虾蛄性腺指数和肝胰腺指数，其中体质量、卵巢质量和肝胰脏质量均为湿质量状态下所测数据。

性腺指数/%=m1/m×100%

肝胰腺指数/%=m2/m×100%

式中，m为体质量，m1为卵巢质量,m2为肝胰脏质量。

1.2.3 糖原与蛋白含量测定

将第0、5、10、15、20 d和25 d采集到雌性口虾蛄卵巢、肝胰脏和肌肉组织按取样时间分别混匀，制成混样。一方面，设置3组平行，各个组织分别称量出0.2 g，与质量分数为0.9%生理盐水，按体积比1∶9混合匀浆，7500 r/min离心10 min后取上清液，使用蛋白质测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定不同组织的总蛋白含量；另一方面，按取样时间将各个组织的混样冷冻干燥后，也设置3组平行，分别称量0.05 g，采用蒽酮比色法测定糖原含量。

1.2.4 数据处理

试验数据用平均值±标准误表示。使用独立样本T检验检验同一取样时间试验组与对照组间的差异。*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)；使用单因素方差依次分析整个试验阶段性腺指数和肝胰腺指数及生化组成的变化。当方差齐时，使用Turkey命令进行组间多重比较；当方差不齐时，使用Tamhane′s T2 (M) 进行近似检验，以不同字母表示具有统计学意义的差异 (P<0.05)。

2 结 果

2.1 切除眼柄的雌性口虾蛄的性腺指数

试验组口虾蛄性腺指数在切除眼柄后逐渐上升，在第15 d达到峰值(12.1%)后下降；而对照组口虾蛄性腺指数在整个试验期间也存在相应趋势。此外，在第5、10、15 d时，试验组口虾蛄性腺指数显著高于对照组(P<0.01)(图1)。

2.2 切除眼柄的雌性口虾蛄的肝胰腺指数

试验期间，对照组与试验组口虾蛄肝胰腺指数分别为2.5%～3.3%和2.6%～3.4%，变化趋势基本一致。在各取样点，试验组与对照组差异不显著(P>0.05)，但试验前期(第0、5、10 d)的肝胰腺指数显著高于后期(第15、20 d)(P<0.05)(图2)。

2.3 切除眼柄后雌性口虾蛄各组织糖原的含量

切除眼柄前，雌性口虾蛄卵巢中糖原含量为1.0%。切除眼柄后，卵巢中的糖原含量逐渐上升，在眼柄切除后第15 d达到峰值(3.0%)后下降，在第20 d降至1.7%，试验组内存在显著差异(P<0.05)(图3)。对照组卵巢中的糖原含量也呈现先升后降的趋势，在第10 d达到峰值(2.4%)后回落；组内各取样点间也存在显著差异(P<0.05)。试验组糖原含量高于对照组，在第5、15 d两者分别具有显著(P<0.05)和极显著差异(P<0.01)。

切除眼柄前，雌性口虾蛄肝胰脏中糖原含量为1.0%，之后，试验组糖原含量逐渐上升，在第10 d上升至最大值(5.2%)后下降，且试验组内各取样点间存在显著差异(P<0.05)(图3)；对照组肝胰脏中的糖原含量变化趋势与试验组类似。然而，各采样点试验组的糖原含量均明显高于对照组，差异极显著(P<0.01)。

图1 切除眼柄后雌性口虾蛄的性腺指数不同大写和小写字母分别代表试验组和对照组组内取样点间差异显著(P<0.05).*，代表试验组和对照组差异显著(P<0.05)，**，代表试验组和对照组差异极显著(P<0.01).其他图同.

图2 切除眼柄后雌性口虾蛄的肝胰腺指数

切除眼柄前，雌性口虾蛄肌肉中糖原含量也为1.0%，而后试验组肌肉中的糖原含量逐渐上升，并在第5 d达到最高值(2.4%)，随后不断下降，第25 d达最低值(0.6%)，组内各取样点间存在显著差异(P<0.05)。对照组肌肉中的糖原含量变化趋势与试验组类似，起初逐渐升高，在第10 d达到最高值(2.4%)后逐渐下降，同样至第25 d达最低值(0.2%)，组内各取样点间差异显著(P<0.05)。试验组糖原含量在第25 d显著高于对照组(P<0.05)。

2.4 切除眼柄后雌性口虾蛄各组织蛋白的含量

切除眼柄前，雌性口虾蛄卵巢中的蛋白含量为113.4 mg/g，切除眼柄后，卵巢中的蛋白含量在第0～10 d无明显变化，在第15 d达到峰值(142.4 mg/g)，随后下降。在整个试验阶段，对照组口虾蛄卵巢中的蛋白含量波动不大，在第20 d达到峰值(125.7 mg/g)。眼柄被切除后，卵巢中的蛋白含量高于对照组，在第15 d存在极显著差异(P<0.01)。

图3 切除眼柄后雌性口虾蛄不同组织的糖原的含量

切除眼柄前，雌性口虾蛄肝胰脏中蛋白含量为31.5 mg/g，切除眼柄后，蛋白质含量显著上升，于第25 d上升至最高值(55.3 mg/g)。对照组肝胰脏中的蛋白质含量变化规律与试验组不同，蛋白含量在0～5 d逐渐上升，而在5～10 d迅速下降，并到最低值(20.7 mg/g)，随后蛋白含量再次上升。试验组肝胰脏中的蛋白含量在第10 d显著高于对照组(P<0.05)。试验组和对照组中，组内各取样点间的蛋白含量差异显著(P<0.05)。

切除眼柄前，雌性口虾蛄肌肉中蛋白含量为47.0 mg/g，切除眼柄后，肌肉中的蛋白含量略微上升，并在第10 d达到最高值(64.3 mg/g)，随后下降，第25 d达最低值(44.2%);组内各取样点间，蛋白含量差异并不显著。对照组在第10 d达到最高值(88.9 mg/g)，显著高于试验组(P<0.05)；随后也开始下降，至第25 d也达最低值(44.1 mg/g)；对照组各取样点间的蛋白含量存在显著差异(P<0.05)。

图4 切除眼柄后雌性口虾蛄不同组织的蛋白含量

3 讨 论

位于眼柄的X器官—窦腺复合体能够分泌多种神经肽类激素，包括性腺抑制激素、蜕皮抑制激素、高血糖激素等[30-31]。其中分泌的性腺抑制激素最先见于雌性虾蟹类，因此又称卵黄发生抑制激素[32]。后来发现雄性体内也分泌该激素[33]。DeKleijin等[34]对美洲龙虾(Homarusamericanus)生殖周期中X-器官性腺抑制激素的mRNA表达及血淋巴组织中的积累含量研究发现，性腺抑制激素只在卵黄发生前期和未成熟期的血淋巴组织中高表达。故推测，性腺抑制激素可能抑制卵黄发生。Warrier等[35]比较欧洲龙虾(H.gammaeus)幼体和成体卵黄发生抑制激素发现，幼体含量远高于成体，认为卵黄发生抑制激素在幼体期高表达有利于机体发育，在成体期低表达有利于卵巢发育，在性腺发育期起抑制作用。性腺抑制激素靶器官为卵巢和肝胰脏，它能抑制卵黄发生和成熟，进而抑制甲壳动物的卵巢发育，故切除眼柄可加速虾蟹类卵巢成熟。Panouse[23]首次提出在锯齿长臂虾卵巢发育期，切除眼柄阻碍性腺抑制激素分泌，可促进卵巢体积增大、卵黄沉积。在其他甲壳类的研究中得到类似结果[36]。

3.1 切除眼柄后对雌性口虾蛄卵巢的影响

口虾蛄一年性成熟，生物学最小型约为8 cm[14]。Ohtomi等[10]认为日本东京湾口虾蛄繁殖季节在4—8月，性成熟高峰期有2个，分别为4—5月和7—8月。第1个高峰由体长超过10 cm的成熟雌体形成；第2个高峰则由体长超过8 cm的成熟雌体形成。薛梅等[9]认为，皮口海域雌性口虾蛄性成熟高峰期也有2个，推测产卵盛期在 5—9 月和 11—12 月。此外，孙丕喜等[19]发现体长大于10 cm 的雌性口虾蛄可以进行人工繁育。本试验中所采集的口虾蛄样本体长为10.20～15.20 cm，故适宜人工促熟研究。

本试验中，切除单侧眼柄后，口虾蛄性腺指数呈上升趋势，切除后5～15 d显著高于对照组，意味着与其他虾蟹类一样，口虾蛄眼柄中可能也存在抑制卵巢发育的性腺抑制激素[37]。上述性腺指数结果与凡纳滨对虾眼柄切除后的报道[38]一致。同时，本试验还发现，眼柄切除后第20 d，对照组与试验组性腺指数差异不显著(P>0.05)。前期预试验表明，双侧切除口虾蛄眼柄致死率高，因此试验中采用单侧眼柄切除方法，但单侧切除并未能完全抑制性腺抑制激素的分泌，这可能是导致试验组性腺指数在20 d时出现下降的主要原因。此外，也有文献报道，雌性口虾蛄在繁殖期，对所处环境因子，如底质、洞穴结构和光等要求严格，若人工养殖的某种环境条件不同于自然环境，很可能对卵巢发育有一定的抑制作用，可能造成试验组口虾蛄性腺指数下降[39]。另一方面，对日本囊对虾等甲壳类研究发现，肝胰脏的营养物质可以通过血液传输到卵巢用以储存和代谢[40-41]。试验结果表明，试验组、对照组肝胰腺指数在试验后期均出现显著下降(P<0.05)，推测口虾蛄卵巢在发育过程中，肝胰脏中的营养物质被消耗或者转移至卵巢所致。

3.2 切除眼柄后对雌性口虾蛄生化组分的影响

葡萄糖是甲壳类血淋巴中的主要单糖，能参与合成黏多糖、几丁质、核糖等，或以糖原形式贮存作能源[42]。血淋巴中葡萄糖水平的稳定对神经、肌肉以及生殖系统功能至关重要[43]。肝脏是脊椎动物的主要贮能器官，当机体需要能量时，迅速从肝脏调取能量以供机体使用[44]。而包括甲壳类在内的无脊椎动物，一般没有单独的贮能器官[45]。试验发现，试验组和对照组的口虾蛄，在卵巢、肝胰脏和肌肉中糖原含量均呈现先升后降的趋势。同时，试验组口虾蛄卵巢和肝胰脏中的糖原含量高于对照组，肌肉中的糖原含量从5 d开始下降，明显早于对照组。这些结果说明，无论眼柄是否被切除，在卵巢发育过程中，3种组织中的糖原均作为最直接的供能物质，为卵巢发育提供能量；切除眼柄组的口虾蛄能量转移与代谢程度更高。

蛋白质是生命体维持生命活动的物质基础，为卵巢发育提供营养物质等，在甲壳类动物卵巢发育中具有重要作用[46]。一般来说，卵黄蛋白原是雌性卵生成熟甲壳动物中的特异蛋白；也是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体；主要作为一种分子载体运输营养物质到卵细胞，为胚胎发生和早期幼体发育提供蛋白质以及微量元素等[47]。刘海映等[48]研究发现，口虾蛄卵黄蛋白原mRNA在肝胰脏和卵巢中均有表达，表明两种组织均为卵黄蛋白合成部位。在其他甲壳类中，如凡纳滨对虾和锯缘青蟹(Scyllaserrata)，均发现肝胰脏和卵巢是其卵黄蛋白原的主要合成部位[49-50]。Quackenbush等[51]发现，切除凡纳滨对虾单侧眼柄7～14 d，卵巢和肝胰脏中卵黄蛋白原合成速度加快。Pateraki等[52]研究亦发现，在切除雌性陆蟹(Potamonpotamios)眼柄后，卵黄蛋白合成加速。本研究发现，切除眼柄后，口虾蛄肝胰脏中蛋白质含量不断上升，表明切除单侧眼柄，可能促进肝胰脏中蛋白质，尤其是卵黄蛋白的合成，有助于卵巢发育。而在卵巢和肌肉中蛋白质含量的往复变化特征可能与物质迁移与代谢有关。上述结果与凡纳滨对虾眼柄切除结果[38]存在差异，这可能是两者取样时间不同造成的；但与中华绒螯蟹研究结果[26]类似。

本试验研究了切除眼柄后雌性口虾蛄的性腺指数和肝胰腺指数的变化特征，以及卵巢、肝胰脏和肌肉中生化组成成分与对照组间的对应关系，试验结果有助于加强口足目甲壳动物性成熟促进机理的认知，为丰富口虾蛄繁殖内分泌学研究提供基础资料。