黑木耳菌种及培养基的筛选

陈方昕，李文光，马小丽，曲永艳(.哈尔滨市林业科学研究院，黑龙江 哈尔滨 5009；.哈尔滨市林业局基金站，黑龙江 哈尔滨 5008；.哈尔滨市林业调查规划设计院有限公司，黑龙江 哈尔滨 50000)

黑木耳〔Auriculariaauricula(L.ex Hook.)Underw〕，别名光木耳、树耳[1]。隶属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌亚门(Agaricomycotina)、伞菌纲(Agaricomycetes)、木耳目(Auriculariales)、木耳科(Auriculariales)、木耳属(Auricularia)，是我国传统的食用菌[2]。

黑木耳是一种大型真菌，其菌丝体由多具横隔和分支的管状菌丝组成[3]。子实体由朽木内的菌丝体发育而来，初期为半透明的黑灰色圆锥形，后呈杯状，最后变为叶状或耳状，基部狭细，近无柄，耳片直径多为4～12 cm，厚度0.8～1.2 mm，其胶质富有弹性，经干燥后的黑木耳会明显收缩，质地变得硬而脆[4]。黑木耳子实体多为深褐色或黑色，呈背凸腹凹状，其背面有柔软而细小的短绒毛，腹部表面多呈平滑状，有些带有脉络状褶皱[5]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

地栽黑木耳有很多优质高产的品种，本研究主要选用了黑29、延明1号、黑916、延农11、长白山7号等作为试验用菌种。

1.2 试验方法

1.2.1 母种筛选

(1)培养基制作。称量去皮后的马铃薯块200 g，沸水煮30 min后过6层纱布得到土豆液。在1 000 mL土豆液种加入琼脂20 g、蛋白胨10 g，加热至完全溶化后分装成4瓶，121 ℃高压条件下灭菌20 min。

(2)菌种转接。将灭菌后的培养基在超净工作台中分装制成PDA平面培养基，每培养皿含45 mL培养基。将培养皿底部画好十字线灭、烘干备用。待上述培养基冷却凝固后，将上述7个不同菌种接到培养底部划好的十字架交点处，菌种直径为3 mm，每个菌种接种3个平板。

(3)菌落生长速度测定。将接种后的培养皿放入25 ℃的黑暗条件下倒置培养，待菌丝萌发后每隔一天定时对菌落直径测定，记录结果，并依据以下公式计算菌落生长速度。

菌落生长速度=(菌落直径平均值—接种菌柄直径)/培养天数

(4)菌丝生长势评价。根据菌落颜色、粗壮程度、浓密等指标来衡量。

1.2.2 母种培养基确定 将上述筛选出的黑木耳优质菌株接种到不同配方的培养基中，而后将培养皿置于25 ℃条件下进行黑暗恒温培养。期间每天定时观察记录其菌丝的生长密度、色泽及菌丝长势，同时待菌丝长满后每隔一天对菌直径进行测定记录，最后通过菌丝的生长速度及菌丝生长密度、菌丝生长势等指标筛选出最适的母种培养基配方。

①：马铃薯200g + 葡萄糖 20 g；

②：①+ 蛋白胨 3 g；

③：② + 酵母膏 2 g；

④：①+ KH2PO43 g、MgSO40.5 g；

Sephadex G-75 凝胶柱分离纯化：洗脱液为Tris-HCl，洗脱速度为 0.1 mL/min，上样量为20 mL，在280 nm下收集各峰，检测活性，收集活性最高的组分于冰箱冷冻保存。

⑤：④+ VB110 mg；

以上各配方均含有琼脂 20 g、水 1 000 mL。

1.2.3 原种培养基筛选 将木屑、麦麸、米糠、蔗糖、石灰，石膏等按不同比例配制，分别装于250 mL 三角瓶中至满刻度，尽量使每瓶料质量及松紧度一致，将其表面压平，纱布棉花塞口后牛皮纸覆包，湿热灭菌(121 ℃，70 min)后冷却至室温，在超净台内接种，每瓶料面中央接等量一级菌种， 25 ℃暗培养，期间注意通风。定期观察各配方菌种萌发情况、菌丝长势及满瓶时间等。每个配方设5个重复。配方如下：

A:木屑78%、麦麸20%、石灰1%、石膏1%；

B:木屑78%、麦麸20%、蔗糖1%、石灰0.5%、石膏0.5%；

C:木屑78%、米糠21%、石灰0.5%、石膏0.5%；

D:木屑78%、米糠21%、蔗糖0.5%、石膏0.5%。

2 结果与分析

2.1 母种的筛选

表1 不同菌种在PDA培养基中的生长速度

表2 不同菌种在PDA培养基中的生长速度方差分析结果

表3 不同菌种的菌丝生长情况

2.2 母种培养基筛选

表4至表6显示：延明1号的菌丝长势在配方⑤号培养基中生长状况最好，菌丝洁白，菌落丰厚且边缘整齐；其次是配方③和④；从密度和长势衡量，①号配方较③号和④号略次；配方②生长状况最差，菌丝灰白，菌丝长势较弱。从菌丝生长速度看，配方⑤菌丝生长速度最快，为4.71 mmd-1且与其他各组间差异显著；配方④菌丝生长速度次之；配方①和配方③菌丝生长速度较慢，且组间差异不显著；配方②生长速度最慢。综合考虑，配方⑤为最佳母种培养基，配方④次之，因此在生产中应采用配方④和配方⑤。

表4 不同培养基菌丝生长状况

表5 黑木耳延明1号菌种在不同培养基生长速度

表6 黑木耳延明1号菌种在不同培养基生长速度方差分析结果

2.3 原种制作

2.3.1 不同原种培养基配方

表7 各配方满瓶时间及菌丝状态

由表7可知，上述4种原种培养基配方中，配方D菌丝满瓶时间最快为20 d，菌丝密度较密，菌丝生长势粗壮，色泽为淡白色；配方B菌丝满瓶时间较配方D稍慢为22 d，但其菌丝密度很密，生长粗壮，色泽为洁白色；配方A和配方C菌丝生长满瓶时间很慢，且菌丝密度稀疏，菌丝生长势较弱，色泽为灰白色和淡白色。综合考虑，配方B为最佳母种培养基，配方D次之，因此在生产中应采用配方B和配方D。

2.3.2 原种制作技术

二级菌种制作过程：配料—装瓶—塞棉塞—装筐—灭菌—冷却到30 ℃。

在经消毒的接种室内进行接种，两个人操作：一人持拔开棉塞的原种瓶，另一人用接种针在母种试管斜面取约1.5 cm2的菌丝块迅速移入原种瓶中，棉塞经火焰消毒后塞上。每支菌种可扩繁8瓶二级菌种，接种完成后可放入培养室培养，前7～10 d温度控制在25～28 ℃，之后温度保持在25 ℃。

3 结论

本论文通过对黑木耳菌种和培养基的筛选、栽培条件的试验系统地对黑木耳产业化生产工艺进行研究，主要结果如下：

3.1 通过对7种黑木耳菌种的栽培试验，筛选出了优良的黑木耳栽培菌种，得出延明1号，延明11号和蛟耳329可以作为黑木耳产业化生产菌种；通过母种培养基试验，筛选出了黑木耳最适的培养基配方：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、VB110 mg、琼脂 20 g、水1 000 mL。

3.2 通过对不同原种培养基的配方筛选试验，得出最佳培养基配方为配方B: 木屑78%、麦麸20%、蔗糖1%、石灰0.5%、石膏0.5%。其次为配方D：木屑78%、米糠21%、蔗糖0.5%、石膏0.5%。

3.3 通过对不同栽培种培养基的配方筛选试验，根据黑木耳栽培产量和品质，得出最佳培养料配方：锯末86.5%、麦麸10%、豆饼粉2%、生石灰0.5%、石膏粉1%。