液质法测定婴幼儿米粉中壬基酚和丙烯酰胺

王浩，赵丽，于晓瑾，张杉，孙龙，潘红艳

（国家食品质量安全监督检验中心，北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100094）

婴幼儿营养米粉是以一种或多种谷物（如：小麦、大米、大麦、燕麦、黑麦、玉米等）为主要原料，且谷物占干物质组成的25%以上，添加适量的营养强化剂和（或）其他辅料，经加工制成的适于6月龄以上婴儿和幼儿食用的辅助食品。近年来，国家对婴儿配方食品质量监管日趋严苛，除了定期对日常营养指标检测外，一些婴儿配方食品中可能存在的有毒及环境污染物物质也列入风险监测，其中就包括近年人们越来越重视和关注的壬基酚[1]（环境污染物）和丙烯酰胺[2]（高温加工淀粉类食品中常见的一种有毒物质）。壬基酚已被证明具有内分泌干扰效应，主要用于生产表面活性剂、也用于抗氧剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域。壬基酚属有机污染物，有“精子杀手”之称。淀粉类食品在高温（＞120℃）烹调下容易产生丙烯酰胺。研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员率先报道，在一些油炸和烧烤的淀粉类食品，如炸薯条、炸土豆片等中检出丙烯酰胺，而且含量超过饮水中允许最大限量的500多倍。之后挪威、英国、瑞士和美国等国家也相继报道了类似结果。丙烯酰胺被国家癌症研究机构列为2A类致癌物质。目前，测定壬基酚和丙烯酰胺残留的文献比较多，方法主要是气相-气质联用法[3-5]和液相-质谱联用法[6-10]等。目前还未见液相色谱-质谱联用法用于同时检测壬基酚和丙烯酰胺的报道。建立一种灵敏、简便、准确、精密的LC-MS/MS法同时测定婴儿营养米粉中壬基酚和丙烯酰胺的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

甲醇（色谱纯）：德国Fisher公司；壬基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素（含量≥99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；试验所选用样品为超市购买；其他试剂均为国产分析纯。Agilent 6410型串联三重四极杆质谱仪（配Agilent1200型液相色谱仪）：美国Agilent公司；B-300型旋转蒸发器：瑞士步琦有限公司；KH-5200型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；Vortex-Genie 2涡旋仪：德国Scientific Industries公司；Milli-Q去离子水发生器：美国Milli-Q公司。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取10.0 mg的壬基酚和丙烯酰胺标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1mg/mL的标准储备液，-18℃以下保存。

内标储备液：准确称取10.0 mg的壬基酚和丙烯酰胺同位素内标于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1mg/mL的标准储备液，-18℃以下保存。

中间浓度标准溶液：用甲醇分别将壬基酚和丙烯酰胺标准储备液配制成浓度为2.5 μg/mL的中间浓度标准溶液，4℃以下保存。

中间浓度内标溶液：用甲醇分别将壬基酚和丙烯酰胺内标储备液配制成浓度为1 μg/L的中间浓度内标溶液，4℃以下保存，在3个月内稳定。

混合基质标准校准溶液的制备：称取阴性样品，分别加入适量的中间浓度标准溶液，使壬基酚添加浓度分别为 1.5、5、25、100、250 ng/mL；丙烯酰胺最终添加浓度分别为 10、25、50、100、200 ng/mL。配得不同浓度的混合基质标准校准溶液后，按照样品测定前处理方法，同检测样品一起前处理并上机检测。

1.3 液相色谱分析条件

色谱柱：资生堂 MGⅢ-C18柱，（4.6 mm×150 mm，5 μm）。

液相色谱条件：流速0.20 mL/min，柱温25℃，进样量 3 μL，流动相：甲醇（A）+水（B）；梯度洗脱：0～5 min，A保持5%。5 min～7 min，A由5%线性递增至100%。7 min～20 min，A 保持 100%。20 min～20.1 min，A 由100%线性递减至5%。20.1 min～25 min，A保持5%。

1.4 质谱分析条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：壬基酚为负离子模式，丙烯酰胺为正离子模式；检测方式：多反应检测；干燥气：N2；雾化气压力：413.8 kpa；干燥气温度：300℃；干燥气流速：8 L/min。

1.5 样品处理

称取2.5 g样品，精确至0.01 g，置于100 mL比色管中，分别加入20 μL浓度为2.5 μg/L壬基酚中间浓度内标溶液和50 μL浓度为2.5 μg/L丙烯酰胺中间浓度内标溶液，加入10 mL水，涡旋1 min，再加入50 mL无水乙醇充分摇匀后经超声波提取30 min，上清液经滤纸过滤，滤液至100 mL蒸发瓶内，并将其接至旋转器上，于50℃水浴中减压蒸馏至近干，加入5 mL 10%甲醇水溶液充分溶解后，过0.22 μm滤膜待测。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件选择

考虑到壬基酚在环境中普遍存在，使用固相萃取小柱来净化样品，也会带来一定的背景污染，故在试验设计时考虑采用有机溶液直接提取，然后旋蒸富集的方式进行样品前处理。

壬基酚和丙烯酰胺的化学性质差异较大，其中，壬基酚不溶于水，溶于乙醇；丙烯酰胺则既溶于水，又溶于乙醇。同时，米粉基质需要先加水糊化，才能将基质内部的目标化合物释放出来，所以本方法在样品中加入10 mL水，涡旋1min，再加入50 mL无水乙醇超声提取，为了提高检出限，对滤液进行旋蒸富集，试验表明：壬基酚和丙烯酰胺的平均回收率在90.2%～103.1%。

2.2 色谱条件选择

色谱柱的选择：为了有利于目标化合物的分离及色谱峰形的改善，本方法分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）、Wates Atlantis-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）和ZORBAX SB-C18色谱柱（50 mm ×2.1 mm，1.8 μm）进行分离试验，发现资生堂 MGⅢ-C18色谱柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）效果较好，能够满足检测要求。

流动相的选择：因为丙烯酰胺为强极性化合物，而壬基酚为弱极性化合物，因此本方法采用水-甲醇为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离及检测效果，测试开始时，流动相中水-甲醇的体积比为95∶5，0～5 min保持此比例，这一部分主要是分离出丙烯酰胺，然后在5 min～7 min内将改变二者的比例为0∶100，7 min～19 min保持此比例，这一部分主要是洗脱测定液中壬基酚。通过上述三步梯度，在20 min内，可以较好的分离测定液中壬基酚和丙烯酰胺（结果见图1），丙烯酰胺出峰时间为2.968 min，壬基酚出峰时间为16.559 min，峰型对称性良好，附近无干扰峰出现。

图1 壬基酚和丙烯酰胺及其同位素内标的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of target compounds

表1 壬基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素的质谱参数Table1 Instrumental parameters for mass spectrometric analysis

2.3 质谱条件优化

采用流动注射的方式在正、负离子模式下分别对浓度为200 ng/mL的壬基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素进行母离子全扫描，得到目标化合物的分子离子峰。选取相应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，然后再对得到的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，选取丰度较强、干扰较小的两个子离子作为定性与定量离子。最终得到基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素的最佳质谱参数，结果见表1。

从表1中可知，壬基酚母离子为219.2，选择两个灵敏度相对较高的稳定子离子，组成定性离子对，132.9和147.0，其中灵敏度较高的子离子132.9为定量离子，丙烯酰胺的母离子为72.1，定性离子对为55.1和44.1，其中55.1为定量离子，根据品牌和型号的不同，仪器参数略有差别。

2.4 基质效应的影响

化学分析中，基质指的是样品中被分析物以外的组分。婴幼儿营养米粉样品富含蛋白质、淀粉和各种营养添加剂，这些基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过添加已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线，因此，为了准确定量，本方法在加入同位素的空白样品中进行标准添加，配成了系列浓度的混合基质标准校准溶液，较大程度消除了基质效应的影响。

2.5 线性关系、检出限及定量限

用系列浓度的混合基质标准校准溶液，分别进样3 μL，测定结果经线性回归（y为峰面积，Counts；x为浓度，μg/L），同时用空白样品进行加标试验，在信噪比均大于3的条件下能检出，将此添加量定为检出限；在信噪比均大于10的条件下能检出，将此添加量定为定量限。结果见表2。

表2 壬基酚和丙烯酰胺的线性方程、线性关系、相关系数检出限及定量限Table2 Linear equations with correlation coefficients，limits of detection and quantification of the method

壬基酚在 1.5 μg/kg～250 μg/kg范围内，线性关系良好，检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和1.5 μg/kg，丙烯酰胺在 10 μg/kg～20 μg/kg范围内，线性关系良好，检出限和定量限分别为3.0 μg/kg和10.0 μg/kg。

2.6 方法回收率和精密度

每组准确称取空白样品6份，每份2.5 g共3组，分别定量加入目标标准物质，第一组添加水平：壬基酚为50 μg/kg，丙烯酰胺为20 μg/kg；第二组添加水平：壬基酚为 100 μg/kg，丙烯酰胺为 50 μg/kg；第三组添加水平：壬基酚为 200 μg/kg，丙烯酰胺为 100 μg/kg。

按供试品溶液制备方法制备后进行测定，结果见表3。

表3 加标样品回收率与相对标准偏差（n=6）Table3 Recovery and relative standard deviation（RSD）in spiked sample（n=6） %

图2 壬基酚和丙烯酰胺阳性样品的MRM色谱Fig.2 MRM chromatogram of a positive sample containing nonyl phenol and Acrylamide

从表3中可看出，不同浓度平均加标回收率90.2%～103.1%，平均相对标准偏差为3.80%～4.87%（n=6）。

2.7 实际样品检测

利用本方法对市场销售的30种婴幼儿营养米粉进行检测，其中24个样品检出壬基酚（浓度为11.8 μg/kg～101.4 μg/kg），6 个样品检出丙烯酰胺（浓度为10.4 μg/kg～31.5 μg/kg）其余未检出。图 2 为壬基酚和丙烯酰胺阳性样品质谱图。结果表明，壬基酚和丙烯酰胺广泛存在于婴幼儿营养米粉中，其对婴幼儿健康存在的风险应当引起重视。

3 结论

建立了婴幼儿营养米粉中壬基酚和丙烯酰胺残留的液相色谱-串联质谱测定方法。该法样品加标回收率方法回收率为90.2%～103.1%，相对标准偏差（RSD）为3.80%～4.87%。方法的灵敏度和准确度均满足实际样品检测的需要，完全适于婴幼儿营养米粉中壬基酚和丙烯酰胺残留的监控检测。