响应曲面法优化枸骨果实多糖提取工艺

王清，刘涛，夏新奎，田俊雅

（信阳农林学院食品学院，河南信阳464000）

枸骨（Ilex cornuta）有猫刺、老虎刺等20多种别名，为常绿灌木或小乔木，主要种植在上海市、安徽、江苏、浙江、江西、湖南、湖北等地区[1]。

枸骨的化学成分主要有黄烷类、三萜苷类、苯丙素类等多种有机化合物[2-5]，经研究证明[6-9]其有抗炎杀菌、降低心肌收缩、抗氧化、抗肿瘤有显著作用。枸骨果实可供药用，常用于治疗白带过多和慢性腹泻，也用于阴虚身热、淋浊、崩带、筋骨疼痛等症[10-12]。

枸骨果实中还含有丰富的多糖。多糖是一种重要的生命物质，它参与了细胞的多种生命现象的调节，并且可以强化机体自身的免疫功能。能够增强多种细胞因子的分泌，且对正常细胞无任何毒副作用，这是多糖区别于其它药物的一大优势，该特点有利于我们进一步开发新药，并不断研发其在保健食品和功能性食品中的应用，这是多糖区别于其它药物的一大优势。目前国际国内市场上，具有抗肿瘤、治疗艾滋病等抗病毒药及具延缓衰老作用的天然植物多糖提取物有广阔的市场前景。但迄今为止，国内外对枸骨果实化学成分及功效进行系统研究的报道较少，尤其是对枸骨果实多糖的研究还未见报道。因此，研究优化枸骨果实多糖的提取工艺对枸骨果实资源的开发利用具有重要的科学和实用价值。

1 材料与仪器

枸骨果实采于信阳农林学院羊山校区，经信阳农林学院药用植物教研室鉴定为枸骨果实，干燥后粉碎备用；葡萄糖：上海行知化工厂；苯酚、浓硫酸、丙酮、乙醚、乙醇（均为国产分析纯）；TU-1810型紫外线分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；WK-4008高速药物粉碎机：青州市精诚机械有限公司；LDZ4-0.8型离心机：北京医用离心机厂；H-H6型电热恒温水浴锅：北京科委永兴仪器有限公司；FA1004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司。

2 试验方法

2.1 枸骨果实多糖制备工艺流程

枸骨果实粉末→热水浸提→离心→取上清液减压浓缩→加无水乙醇沉淀→丙酮、乙醚洗涤沉淀→真空干燥枸骨果实粗多糖

2.2 标准曲线绘制（硫酸-苯酚法）补充参考文献

采用苯酚-硫酸法制作葡萄糖标准曲线。最终得到葡萄糖标准曲线回归方程为：Y=5.448 6X+0.004 7,R2=0.992 5。

2.3 单因素试验

分别研究提取时间、提取温度和料液比对枸骨果实多糖提取率的影响。

2.4 提取率的计算

2.5 响应面试验

在单因素优化的基础上，设计优化枸骨果实多糖提取率的响应面试验。依据Box-Benhnken试验设计原理，通过建立多元二次回归模型方程，用多项式对本试验中各个因素与指标的相互关系进行近似拟合，通过对回归方程的分析及各因素交互作用的响应面图形分析来寻求最优工艺参数。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 提取时间对枸骨果实多糖提取率的影响

准确称取1.000 0 g枸骨果实粉末，加入150 mL蒸馏水，设置提取温度为80℃，5份样品的提取时间分别为 0.5、1、1.5、2、2.5 h，在恒温水浴锅中进行提取，冷却离心（1 000 r/min、10 min）。得上清液，测定上清液的吸光度。试验结果如图1所示。

如图1所示，当提取时间为1.5 h时，多糖的提取率达到最大值。在0.5 h～1.5 h之间，随着提取时间增加，多糖提取率不断提高，当提取时间大于1.5 h时，多糖提取率数增长缓慢。因此，考虑到能源消耗与提取率的大小等问题，提取时间选择在1.5 h。

3.1.2 提取温度对枸骨果实多糖提取率的影响

准确称取1.000 0 g枸骨果实粉末，加入150mL蒸馏水，提取时间设定为1.5 h，5份样品的提取温度分别为 60、70、80、90、100 ℃，在恒温水浴锅中进行提取，冷却离心（1 000 r/min，10 min）。得上清液，测定上清液的吸光度。试验结果如图2所示。

图1 时间对枸骨果实多糖提取率的影响Fig.1 Effects of time on extraction rate of polysaccharide from fruits of Ilex cornuta

图2 提取温度对枸骨果实多糖提取率的影响Fig.2 Effects of temperatures on extraction rate of polysaccharide from fruits of Ilex cornuta

图2 所示，当提取温度为80℃时，多糖的提取率达到最大值。在60℃～80℃之间，随着提取温度升高，多糖的提取率不断提高，当提取温度大于80℃时，提取率下降。分析原因可能是温度过高会加大试验过程中的能源消耗与多糖的分解，造成提取量的降低，因此提取温度应选择在80℃左右。

3.1.3 料液比对枸骨果实多糖提取率的影响

准确称取1.000 0 g枸骨果实粉末，5份样品的液料比分别为 115∶1、130∶1、150∶1、165∶1、185∶1（mL/g），提取时间设定为1.5 h，提取温度设定为80℃，在恒温水浴锅中进行提取，冷却离心（1 000 r/min、10 min）。得上清液，测定上清液的吸光度。试验结果如图3所示。

图3 料液比对枸骨果实多糖提取率的影响Fig.3 Effects of ratio of water to material on extraction rate of polysaccharide from fruits of Ilex cornuta

如图3所示，当液料比达到 150∶1（mL/g）时，多糖提取率的增长趋势趋于缓慢。当水料比小于150∶1（mL/g）时，由于样品中的多糖没有充分溶解在溶液中，因此，随着液料比的增大，提取率在升高。水分体积的增加与样品间接触面积增大，因而有更多的多糖充分的溶解在水溶液中，直至水溶液体积过大多糖不再溶解。从节约能源与简化后续操作角度考虑，水料比应选择在 150 ∶1（mL/g）左右。

3.2 响应面优化枸骨果实多糖提取工艺

3.2.1 分析因素的选择及分析方案

根据单因素枸骨果实多糖提取工艺参数，可确定3个因素和3个水平进行枸骨果实多糖提取响应曲面试验，设计见表1，响应曲面试验数据设计见表2。

表1 响应面分析因素与水平表Table1 Factors and levels of the response surface analysis

表2 试验方案及试验结果Table2 Test approaches and result of the response surface analysis

续表2 试验方案及试验结果Continue table 2 Test approaches and result of the response surface analysis

3.2.2 模型方程的建立与显著性检验

使用Design Expert 8.0.5对表2中枸骨果实多糖提取率多元回归拟合，得到回归方程：

Y=28.04+0.15A+0.86B-1.32C-0.38AB+2.42AC+1.45BC-5.83A2-4.53B2-7.45C2中，该方程可以表示液料比、提取温度、提取时间三因素与提取率的关系。Y为枸骨多糖的提取率，%；A为提取温度，℃；B为提取时间，h；C为液料比，mL/g，对回归方程进行方差分析如表3所示。

表3 响应面回归方程的方差分析Table3 Analysis of variance of the response surface regression equation

从表3可知P＞F值表示大于F值的概率，根据P值判断各交互项极其显著影响枸骨果实多糖的提取率，P＜0.01 为极显著，0.01＜P＜0.05为显著，P＞0.05 为不显著。经过分析实验结果数据可知A、B的P＞0.05说明差异不显著，C 的 P＜0.05 差异显著，A2、B2、C2、AC 的P＜0.01差异极其显著。回归方程相关系数平方R2=0.978 8，校正相关系数平方Radj=0.951 5。说明该方程可用来分析提取枸骨果实多糖的优化条件，说明3个因素交互作用共同影响多糖提取率，不是单一作用的结果。

3.2.3 多糖提取率的响应面分析

根据二次模型所做的响应曲面图可评价试验因素对枸骨果实多糖提取率的两两交互作用，以及确定各因素的最佳水平范围。等高线形状可反映出交互效应的强弱，等高线形状是椭圆形表示两因素交互作用显著，如果是圆形则表示两交互作用可忽略。两两因素交互作用对枸骨果实多糖提取率影响的响应面3D图如图 4、图 5、图 6。

图4 提取时间和提取温度对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time and extraction temperature on extraction rate

由图4可知：随时间和提取温度的增大，枸骨多糖提取率值呈现先升高后下降的趋势。在提取温度80℃，液料比150∶1（mL/g）左右，枸骨多糖提取率数值最大。通过曲面斜率与试验因素的影响大小的关系可知，温度对考察指标的影响更大。

图5 提取时间和液料比对提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time and liquid to material ratio on extraction rate

由图5可知：曲线比较陡峭，二者对提取率的影响作用较大。在相同温度条件下，随着液料比、提取时间的增加，枸骨多糖提取会呈现先增大后减小的趋势。液料比为150∶1（mL/g），提取时间为1.5 h时枸骨多糖提取率数值最大。

图6 提取温度和液料比对枸骨多糖提取率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature and liquid to material ratio on extraction rate

通过曲面斜率与试验因素的影响大小的关系，由图6可知，与提取温度相比，提取液料比对所考察指标的影响更大。在相同的时间条件下，随着温度和液料比的增加，枸骨多糖提取率会呈现先增大后减小的趋势，但是减小的趋势比增加的趋势小。提取温度为80℃，液料比为150∶1（mL/g）时枸骨多糖提取率数值最大。

3.2.4 试验的验证

通过Design Expert8.0.6.0分析得到模型的极大值点为：料液比 150 ∶1（mL/g）、提取温度 80℃、提取时间1.5h。最佳提取率为29.12%。为了验证试验方案的有效性，设计3组平行试验，取平均值得实际提取率为28.84%。实际值与理论值相差0.96%，误差较小。所以通过Design expert 8.0.6.0软件得到的枸骨果实多糖提取率的回归方程有效，具有参考价值。

4 结论

由单因素试验和响应面试验的结果可知，枸骨果实多糖提取工艺的最佳条件为：液料比为150∶1（mL/g），提取温度为80℃，提取时间为1.5h，此条件下，枸骨果实多糖提取率为29.12%。由试验验证得提取率为28.84%，多糖提取率实际值比理论值小0.96%，响应面法优化枸骨果实多糖提取率工艺参数可靠有效。