何首乌中蒽醌类物质提取及抗氧化活性研究

李敏，黄小梅，谈文林

（1.达州职业技术学院，四川达州635000；2.四川文理学院化学化工学院，四川达州635000；3.特色植物开发研究四川省高校重点实验室，四川达州635000）

何首乌（Polygonum multiflorum Thunb）为蓼科植物何首乌的干燥块根，长椭圆形，呈红褐色至暗褐色[1-2]。中药何首乌分为生首乌和制首乌，生首乌具有解毒（截疟）、消痈、润肠通便等功效；制首乌具有强筋骨、补益精血、补肝肾、乌须发等功效[3-5]。何首乌所含的蒽醌类、二苯乙烯苷类和磷脂类化合物是其药理作用的物质基础[6]。蒽醌类化合物主要包括大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、和大黄酸等化学成分，是何首乌中的主要活性物质[7]。现代药理学研究表明：蒽醌类化合物具有活血化瘀、抗菌消炎、调节免疫功能、保肝护肝、利尿和抗肿瘤等作用[8-10]。

目前何首乌蒽醌类物质的提取方法主要有溶剂回流法、超声波辅助提取法、大孔树脂吸附法和微波提取法等[11-13]。超临界CO2萃取技术是近年来发展起来的一种新型提取技术，具有对物质结构无损伤、无毒无残留、速度快、提取效率高和易分离等优点，特别适合天然药物有效成分的分离[14-15]。本文以何首乌中的蒽醌类物质为研究对象，采用超临界CO2萃取技术提取得到蒽醌类物质，利用紫外分光光度法对蒽醌类物质进行检测，通过超临界CO2萃取条件筛选，正交试验工艺优化，得到蒽醌类物质提取最佳工艺参数，同时将蒽醌类物质的分离纯化产物进行抗氧化活性检测研究，为何首乌的综合开发利用提供试验技术支持。

图1 大黄素标准曲线Fig.1 Standard curve of measuring content of emodin

1 材料方法

1.1 材料与仪器

何首乌：四川达州产，45℃条件下恒温干燥，粉碎后过筛，备用；大黄素标准试剂：中国标准物质中心，用前干燥至恒重；S-8大孔树脂：天津浩聚树脂科技有限公司，用前进行预处理；VC、醋酸镁、无水乙醇等其它试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

SFE-2超临界CO2萃取仪：美国ASI公司；R-1001VN旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；FA2004N电子天平：上海丙林电子科技有限公司；DZ-1AII真空干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；ZWF-110X50恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；F-500小型中药粉碎机：新昌县德科机械有限公司。

1.2 标准曲线绘制

准确称取经干燥至恒重的大黄素标准品5.0 mg，用无水乙醇溶解并定容至25 mL，摇匀得200 mg/L的对照储备液。分别精密吸取对照储备液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于25 mL容量瓶中，再加入1%的醋酸镁显色剂2.5 mL，摇匀使充分混合后显色30 min，用无水乙醇定容，分别测定不同浓度在506 nm处的吸光度，至少检测3次取平均值，以大黄素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制大黄素标准曲线，图1所示。线性回归方程y=0.031 5x+0.001 3，相关系数r=0.999 9，线性关系良好。

1.3 蒽醌类物质提取及测定

准确称取过筛后的何首乌粉末200 g，装入仪器中，设定好试验所需萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂含量等试验仪器参数，进行试验，收集提取产物，按1.2方法处理样品后用无水乙醇定容，结合大黄素标准曲线，通过分光光度法进行样品定性定量分析，按公式计算何首乌中蒽醌类物质的提取率。

其中：C为蒽醌类物质浓度，mg/L；V为萃取液体积，L；M 为何首乌质量，g。

1.4 正交试验

为进一步优化超临界CO2萃取中各因素对蒽醌类物质提取效率的整体影响情况，对萃取温度（A）、萃取压力（B）、萃取时间（C）和夹带剂含量（D）进行L9（34）正交试验，方案设计见表1所示。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels chart

1.5 蒽醌类物质分离纯化

将经过预处理的S-8大孔树脂装入层析柱（Φ 30 mm×L 550 mm）中，将1.3中的提取液减压浓缩后，用无水乙醇溶解，过滤、洗涤，再用蒸馏水定容，制成蒽醌类物质浓度为0.65 mg/mL的上柱液，将450 mL上柱液以流速240 mL/h进行装柱，先用100 mL石油醚和乙酸乙酯（体积比2∶1）混合洗脱剂洗脱，除掉蒽醌粗产物中色素和挥发油等极性较小的物质，再用400 mL无水乙醇以流速80 mL/h洗脱，收集产品，减压蒸馏，干燥，得精制蒽醌类化合物。

1.6 清除·OH活性检测

由于H2O2氧化Fe2+，产生大量·OH，水杨酸与·OH显色后在510 nm处有最大吸收，通过分光光度法检测510 nm处吸光度，根据吸光度的变化，可以检测·OH被清除的程度。在10 mL比色管中依次加入1 mL 0.1%的H2O2溶液，1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL不同浓度的精制蒽醌类化合物溶液，使其混合均匀后静置5 min，然后加入1 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，用蒸馏水定容后在37℃条件下水浴30 min，510 nm处测定吸光度，计算蒽醌类物质对·OH的清除率。

其中：E为清除率，%；A0为未加样品的吸光度；A1为未加H2O2的吸光度；A2为加入样品的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 萃取温度对提取率的影响

在不含夹带剂、CO2流量为35 kg/h、萃取压力为20 MPa、萃取时间为2 h的条件下，分别讨论了不同萃取温度对提取率的影响，结果如图2所示。

图2 萃取温度对提取率的影响Fig.2 The effect of extracting temperature on the extraction rate

由图2可知，萃取温度小于55℃时，随着温度的升高提取率迅速增大，萃取温度达到55℃时，提取率达到最大值，之后，随着温度的升高，提取率有所下降。这是因为萃取温度过低时，CO2呈亚临界状态对萃取不利，温度升高有利于物料扩散对萃取有利；萃取温度过高（超过55℃），CO2的密度和浓度降低，溶解能力下降对萃取不利，因此，根据试验结果，选择最适宜萃取温度为55℃。

2.1.2 萃取压力对提取率的影响

在不含夹带剂、CO2流量为35 kg/h、萃取温度为55℃、萃取时间为2 h的条件下，分别讨论了不同萃取压力对提取率的影响，结果如图3所示。

从图3可以看出，提取率随着萃取压力的增大而增大，当萃取压力达到25 MPa时，提取率达到最大值，之后，随着压力的升高，提取率趋于稳定。这是因为萃取压力过低，CO2以亚临界状态存在不利于萃取，随着压力的增加，CO2的密度和浓度增加，被萃取物的溶解能力增强有利于萃取，萃取压力过大，能量消耗增加，提取率趋于稳定。因此萃取压力控制在25 MPa为宜。

图3 萃取压力对提取率的影响Fig.3 The effect of extracting pressure on extraction rate

2.1.3 萃取时间对提取率的影响

在不含夹带剂、CO2流量为35 kg/h、萃取温度为55℃、萃取压力为25 MPa的条件下，分别讨论了不同萃取时间对提取率的影响，结果如图4所示。

图4 萃取时间对提取率的影响Fig.4 The effect of extracting time on extraction rate

由图4可知，随着萃取时间的延长，提取率不断增大，有利于蒽醌类物质的提取，当萃取时间达到2 h时，提取率达到最大值，之后，随着时间的延长，提取率趋于稳定。故萃取时间控制在2 h为宜。

2.1.4 夹带剂含量对提取率的影响

在CO2流量为35 kg/h、萃取时间为2 h、萃取温度为55℃、萃取压力为25 MPa的条件下，分别讨论了无水乙醇夹带剂含量对提取率的影响，结果如图5所示。

从图5可以看出，夹带剂含量小于15%时，随着夹带剂含量的增加提取率迅速增大，夹带剂含量达到15%时，提取率达到最大值，之后，随着夹带剂含量的增加，提取率有所下降。夹带剂用量过大，萃取液量增大，后续处理复杂。因此确定最适宜夹带剂含量为15%。

图5 夹带剂含量对提取率的影响Fig.5 The effect of entrainer content on extraction rate

2.2 正交试验

根据单因素试验结果和正交试验因素水平表，以萃取温度（A）、萃取压力（B）、萃取时间（C）和夹带剂含量（D）四因素为变量，进行L9（34）正交试验，正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table2 The results of orthogonal experiment

从表 2的极差试验结果 RB＞RD＞RA＞RC分析可知，萃取压力（B）对整体何首乌中蒽醌的提取率影响最大，其次是夹带剂含量（D）和萃取温度（A），最后是萃取时间（C）。由正交试验中的k值得出最佳提取工艺为A2B2C3D2，即萃取温度为55℃，萃取压力为25 MPa，萃取时间为2.5 h，夹带剂含量为15%。

2.3 验证试验

采用正交试验的最佳提取工艺参数A2B2C3D2进行5次平行试验，考察何首乌中蒽醌类物质在最佳工艺参数条件下的提取率，其5次平行试验的平均提取率为7.235 mg/g，试验结果见表3所示。

表3 验证试验结果Table3 The results of verification experiment

2.4 抗氧化活性试验

将精制何首乌蒽醌类化合物，用于清除·OH活性试验，实现蒽醌类化合物的抗氧化活性研究。试验过程与VC对比，按1.6方法进行，其试验结果见图6所示。

图6 蒽醌类化合物和VC对·OH的清除能力Fig.6 Scavenging ability on OH·of anthraquinones and VC

从图6中可以看出，在所选试验浓度范围内，何首乌蒽醌类物质与VC对·OH均有较强的清除能力，并随着浓度的增加，·OH的清除能力不断增强，相同浓度时，VC清除·OH的能力比蒽醌类物质稍强。可见，何首乌蒽醌类物质对·OH有较好的清除能力，具有较强的抗氧化活性。

3 结论

试验以何首乌中蒽醌类物质为研究对象，采用超临界CO2萃取技术，探讨了萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂含量4个单因素对蒽醌类化合物提取效率的影响，通过正交试验进行条件优化，确定了超临界CO2萃取何首乌中蒽醌类物质的最佳工艺参数，即萃取温度为55℃，萃取压力为25 MPa，萃取时间为2.5 h，夹带剂含量为15%，并通过验证试验进行验证，提取率达到7.235 mg/g，实现了何首乌中蒽醌类物质的有效提取。通过S-8大孔树脂对提取物进行了分离纯化，获得了精制蒽醌类化合物，将纯化产物应用于清除·OH的抗氧化活性研究，试验结果表明，何首乌蒽醌类物质对·OH有较好的清除能力，具有较强的抗氧化活性。