实时荧光定量PCR检测妊娠晚期孕妇B族链球菌感染的临床价值

雷萍，石艳艳，罗红权，吴雨露，李宁，张丽萍

(四川省妇幼保健院检验科，成都 610045)

B族链球菌(GBS)为革兰阳性兼性厌氧球菌，主要寄生在人体下消化道及泌尿生殖道。GBS为条件致病菌，孕产妇和新生儿感染的主要细菌之一，亦可导致具有基础疾病及免疫力低下人群的机会性感染[1]。孕妇GBS感染可引起胎膜早破、流产、早产、绒膜羊膜炎、宫内感染、胎儿生长受限、孕产妇败血症和产后子宫内膜炎等，可通过垂直传播引起新生儿肺炎、败血症、脑膜炎等[2-3]。但国内对于孕妇GBS感染尚无统一且规范的干预指南，且有研究认为孕妇GBS感染不会影响妊娠结局。我科根据多年的妇科经验显示，孕妇GBS筛查及早期干预对母儿具有重要意义。

目前筛查GBS的常用方法有细菌培养、特异性抗原或抗体测定、核酸探针检测和实时荧光定量PCR等。细菌培养法是诊断GBS感染的金标准，但耗时长，且孕妇生殖道中存有多种细菌，在普通培养基中GBS生长受到抑制，易造成漏诊；GBS抗原或抗体检测可短时间内获得结果，但假阴性率和假阳性率高；PCR检测时间短、灵敏度高。快速获得准确GBS结果，对孕期未进行GBS筛查而在临产时来院分娩的孕妇尤其重要。本实验评价了实时荧光定量PCR检测孕妇GBS感染的临床效能，分析了孕妇GBS感染对妊娠结局的影响。

材料与方法

一、研究对象

选择2015年1月至2016年12月在本院孕妇保健并住院初次分娩的单胎孕妇共3 565例，孕35～37周，年龄23～39岁。根据孕妇意愿，将带GBS的孕妇分为2个组，愿意接受干预治疗的设为干预治疗组，按CDC“围生期GBS预防指南(2010)”[4]，实行产时抗生素预防和治疗，对用药有顾忌不愿接受干预治疗的设为未干预治疗组。

排除标准：非阴道分娩；取材前1月内患感染性疾病，全身或阴道局部使用过抗菌素。

本课题经院伦理委员会同意，所有受试孕妇或家属均签署知情同意书。

二、主要仪器与试剂

LightCycler2.0实时荧光定量PCR仪(罗氏，德国)，VITEK2 Compact微生物鉴定系统(梅里埃，法国)；GBS-DNA提取试剂和扩增试剂盒(北京博尔诚科技)；CAMP蛋白的基因设计特异引物、荧光探针、核酸制备及扩增检测试剂盒(福建泰普生物)；BACT9120全自动血培养系统(BD，美国)；菌种鉴定采用API鉴定系统(中国生物梅里埃)。

三、方法

1.标本采集：擦去外阴分泌物后，将1根无菌拭子插入阴道下1/3，旋转1周采取阴道分泌物，同时采集2根拭子，2根拭子置于1个无菌套管内作为1份标本，密闭；将1根无菌拭子插入肛门，于肛门括约肌上2～3 cm处轻旋转，采取直肠分泌物，同时采集2根拭子，2根拭子置于1个无菌套管内作为1份标本，密闭。标本采集后1 h内送检。经孕妇本人知情同意。

2.GBS培养：按《全国临床检验操作规程》(第4版)。阴道和直肠拭子接种血琼脂平皿，在5%～10%CO2环境下35℃孵育24～48 h。挑取血平皿上有β溶血的菌落进行CAMP试验，并采用VITEK2 compact微生物鉴定系统进一步鉴定。

3.实时荧光定量PCR检测GBS-DNA：对GBS编码CAMP蛋白的基因设计特异引物和荧光探针。核酸制备、扩增检测及阴阳性结果判断严格试剂盒说明书。

4.GBS带菌者判定[5]：直肠分泌物和阴道分泌物任一检出GBS都确定为带菌者。培养出GBS即判定为GBS带菌者；GBS培养阴性而PCR阳性者，则再采集阴道和直肠分泌物做第2次GBS培养和DNA检测，培养法和实时荧光定量PCR法任意一项阳性即判定为GBS带菌者；第1次或第2次标本GBS培养和PCR均阴性判定为未携带GBS者。

直肠/阴道定植率=(直肠/阴道分泌物检出GBS人数)/总人数100%。

5.新生儿细菌感染检测：收集所有新生儿的血标本，采用BACT9120全自动血培养系统检测，菌种鉴定采用API鉴定系统。

四、统计学处理

采用SPSS17.0 统计学软件进行统计分析，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、孕妇GBS携带率

3 565例孕妇确诊为GBS携带者352例，带菌率为9.87%。

二、不同年龄孕妇GBS携带率比较

随着孕妇年龄增加，GBS带菌率有增加趋势，但不同年龄组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 各年龄段孕妇带菌率[n(%)]

三、标本采集部位比较

352例GBS带菌者中，阴道分泌物检出率[40.63%(143/352)]低于直肠分泌物检出率[86.93%(306/352)](P<0.05)；GBS在阴道的定植率[4.01%(143/3 565)]高于直肠[8.58%(306/3 565)](P<0.05)。

四、实时荧光定量PCR法与细菌培养法检测孕妇GBS感染的比较

135例患者细菌培养和实时荧光定量PCR均阳性，3 191均为阴性，6例培养阳性而实时荧光定量PCR阴性，233例培养阴性而实时荧光定量PCR阳性(表2)。

表2 实时荧光定量PCR法与培养法检测结果

五、实时荧光定量PCR法与细菌培养法检测GBS的临床效能

与细菌培养法比，实时荧光定量PCR法对第1次标本检测结果诊断GBS感染的灵敏度(SEN)、特异性(SPE)、阳性预测值(+PV)、阴性预测值(-PV)、阳性似然比(+LR)和准确度均较高，阴性似然比(-LR)较低(表3)。

表3 实时荧光定量PCR法与培养法检测GBS的临床效能(%)

六、各组孕妇不良妊娠结局的比较

胎膜早破、早产、宫内感染、胎儿窘迫和新生儿感染的发生率，未干预治疗组显著高于GBS阴性组和干预治疗组(P<0.05)，而干预治疗组与GBS阴性组无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表4 各组孕妇不良妊娠的发生率[n(%)]

注：与其他两组比较，*P<0.05

七、各组新生儿感染病原检查

各组均出现不同程度的GBS、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等感染，未干预治疗组发生GBS感染数显著增高(P<0.05)，而干预治疗组与GBS阴性组无统计学差异(P>0.05)；其余菌种感染各组间均无统计学差异(P>0.05)(表5)。

表5 各组新生儿感染病原检查[n(%)]

注：与GBS阴性组比较，*P<0.05

讨 论

各种菌群共处于阴道微生态环境中并保持平衡状态，即阴道微生态平衡。GBS为女性生殖道常见细菌，妊娠期体内雌激素和孕激素水平升高、糖原含量增加、阴道pH值改变及免疫功能低下，可能是引起阴道菌群失调，GBS繁殖增加[6]。本研究结果显示，晚期孕妇阴道直肠GBS带菌率为9.87%，低于欧美国家孕妇阴道直肠的带菌率10%～35%[7]，与国内孕妇的带菌率5%～15%[8]一致。流行病学调查显示，欧美孕妇GBS带菌率高于亚洲孕妇[9]。GBS的检出率受多种因素影响，如人种、地域、年龄、检测方法、取材部位和取材时间等[2，8]。本研究结果显示，20～40岁孕妇的GBS带菌率与年龄无关，与文献[9-11]报道一致；直肠分泌物GBS检出率显著高于阴道分泌物，可见两种标本联合检测可提高GBS的检出率。

GBS对特殊人群如孕妇、新生儿有较强的致病性。妊娠期GBS感染的危害远高于非妊娠人群。GBS通过产道上行扩散感染子宫和胎膜，使带菌孕妇易发生晚期流产、早产、胎膜早破、绒毛羊膜炎和产褥感染等，其中早产和流产发生与GBS感染可引起磷脂酶A、前列腺素和炎症因子等大量释放有关[12]。妊娠期GBS感染可通过母婴垂直或水平传播至胎膜，通过炎性细胞的吞噬作用和蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部张力减少，导致产前发生胎膜破裂、合并宫内感染，发生新生儿肺炎、脑膜炎和败血症等疾病[8，13]。本研究显示，未干预治疗的GBS带菌孕妇人群的胎膜早破、早产、宫内感染、胎儿窘迫和新生儿感染的发生率显著高于GBS阴性组和干预治疗组，而干预治疗组与GBS阴性组间无统计学差异，与文献报道[9，14-15]一致，提示晚期孕妇GBS感染可危害孕妇和胎儿或新生儿的健康，在产程过程中对GBS感染孕妇给予抗菌素预防和治疗可有效降低不良妊娠发生率。但也有文献报道，GBS阳性组的胎膜早破、早产、胎儿宫内窘迫和新生儿感染的发生率与阴性组间并无显著性差异[16]，这也是部分妊娠期GBS感染孕妇不接受治疗的原因之一。本研究中三组孕妇均存在不同程度的新生儿GBS感染，未干预治疗组发生GBS感染数明显增高，而干预治疗组与GBS阴性组的新生儿GBS感染数差异无统计学意义，提示GBS也可通过母婴途径传染给新生儿，而给予药物干预可有效抑制GBS自母亲传至新生儿。但3 213例GBS阴性组的仍有8例GBS感染的新生儿，提示GBS阴性组中至少有8例孕妇为GBS假阴性，可能与GBS感染具有潜伏性及间歇性的特点相关，但仍需要更多研究数据考察。

本研究显示，实时荧光定量PCR法检测孕妇GBS感染的灵敏度和特异性为98.30%和99.50%，与文献报道[8，17]基本一致。细菌培养时间较长，一定程度影响了结果判断，假阳性率较高，而实时荧光定量PCR检测时间短，符合产前和产时的筛查要求；少数GBS感染孕妇细菌培养时缺乏溶血环而误判为阴性，此时可以采用实时荧光定量PCR定性。

本研究中有6例细菌培养阳性而实时荧光定量PCR阴性，这可能是因为GBS为革兰阳性菌，细胞壁有较厚的肽聚糖层，细菌难于裂解[18]，或细菌核酸样品中有实时荧光定量PCR抑制剂；16例非GBS带菌者实时荧光定量PCR阳性，这可能是因为标本间交叉污染。由此可见，对实时荧光定量PCR试验，标本处理与核酸制备很重要。对于采用两种方法均未检出的GBS感染，可能与GBS感染具有潜伏性及间歇性有关。

综上所述，实时荧光定量PCR是一种快速准确筛查妊娠晚期GBS的方法。妊娠晚期孕妇GBS感染会导致胎膜早破、早产、宫内感染、胎儿窘迫和新生儿感染的发生率升高，及时采取干预措施可有效降低不良妊娠结局的发生。