乳腺癌组织中miR-320a的表达及意义

程莹星，黄勇，张丽娟，郑虹，姜孝娟

(合肥市第二人民医院，合肥 230001)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，据统计，2008年全球乳腺癌新发病例约138万，死亡约46万，乳腺癌是一种高度异质性疾病，根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)的表达情况，可分为不同分子亚型。流行病学结果显示，ER、PR及HER2表达对乳腺癌患者的预后有较大影响，如三阴性乳腺癌患者的5年总生存率低于其他分子亚型乳腺癌[1]。近年来，NUCB2、Cbx2[2]多种新靶标已用于乳腺癌的诊断、治疗和预后判断，但乳腺癌患者的预后仍不乐观，寻找新的、有效的乳腺癌新靶标，对提高治疗效果、改善患者预后有积极意义。微小RNAs(microRNAs)是由18～25个核苷酸组成的进化保守的非编码小RNA分子，在基因转录后调控中发挥重要作用。大量研究证实，microRNAs与肿瘤形成、恶性进展及预后均密切相关，具有作为肿瘤治疗靶标的潜能，microRNA-320(miR-320)家族共有5个成员，在乳腺癌中的表达有一致性[3]。2013年1～12月，我们观察了乳腺癌组织中miR-320a表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2013年1～12月入住本院行切除手术的乳腺癌患者癌组织及其癌旁组织(距离癌组织>5 cm)新鲜标本，术中取出后立即置于液氮中保存。纳入标准：术前未接受抗肿瘤治疗；初次乳腺癌手术；具备完整的病例和随访资料；签署知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并肝肾等重要器官功能不全等。共收集符合标准的91例乳腺癌患者，年龄29～62岁，其中<55岁患者52例，≥55岁患者39例；已绝经患者42例，未绝经患者49例；肿瘤直径<2 cm者29例，肿瘤直径≥2 cm者62例；ER阴性表达者35例，ER阳性表达者56例；PR阴性表达者33例，PR阳性表达者58例；HER2阴性表达者50例，HER2阳性表达者41例；有淋巴结转移者68例，无淋巴结转移者23例；有远处转移者71例，无远处转移者20例；TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期70例，Ⅲ+Ⅳ期21例。手术成功后，所有患者接受1～60个月的随访，以门诊或电子通讯的方式为主，直至死亡或随访时间结束。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 乳腺组织miR-320a表达检测 采用实时定量PCR(Real-time PCR)法。切取适量液氮保存的组织样本(20～30 mg)，采用TRIzol试剂提取组织中总RNA，紫外分光度计测量RNA纯度和浓度，cDNA合成试剂盒进行反转录，反应条件：30 ℃ 10 min；42 ℃ 30 min；99 ℃ 5 min；4 ℃ 5 min，产物cDNA置于-20 ℃冰箱保存。定量PCR试剂盒进行Real-time PCR反应，反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s；60 ℃ 20 s；40个循环。定量PCR引物序列如下，miR-320a正向引物：5′-TATTCGCACTGGATACGACTCCAGC-3′,反向引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6正向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，反向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-320a相对表达量。

2 结果

2.1 不同乳腺组织中miR-320a表达比较 乳腺癌、癌旁组织中miR-320a相对表达量分别为0.21±0.06、1.14±0.15，二者比较，差异有统计学意义(t=-54.91，P=0.000)。

2.2 miR-320a表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 以miR-320a相对表达量的平均值为界限，>平均值为miR-320a高表达(44例)，≤平均值为miR-320a低表达(47例)。结果显示，乳腺癌组织中miR-320a表达与患者年龄、是否绝经、ER表达、PR表达、HER2表达和TNM分期均不相关(P均>0.05)；miR-320a表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移均有关(P均<0.05)，见表1。

表1 乳腺癌组织中miR-320a表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 乳腺癌组织中miR-320a表达对患者预后的影响 Log Rank检验结果显示，miR-320a高表达者术后5年总生存率81.82%(36/44)，高于320a低表达者的53.19%(25/47)，差异有统计学意义(χ2=8.207，P=0.004)。

3 讨论

microRNAs在细胞不同生理过程中发挥关键性调控作用，如增殖、凋亡、迁移、侵袭、分化和代谢等[4]。研究揭示，在肿瘤形成和恶性进展过程中，根据microRNAs下游靶基因的功能不同，microRNAs既能发挥促癌基因作用又可发挥抑癌基因作用[5]。目前，已在结直肠癌、膀胱癌和胃癌等[6]肿瘤中发现多种异常表达的microRNAs。microRNAs具有成为肿瘤治疗有效治疗靶标的潜能。

有研究发现，miR-17和miR-20b在乳腺癌组织中表达降低，且参与诱导产生紫杉醇耐药，miR-17和miR-20b可作为乳腺癌的治疗靶标[7]。miR-320a在非小细胞肺癌[8]、肝细胞癌[9]等多种肿瘤组织中均存在异常表达。本研究结果发现，与癌旁正常组织相比，miR-320a在乳腺癌组织中的相对表达量降低，提示在乳腺癌肿瘤形成过程中，miR-320a具有抑癌基因功能，其表达降低参与并促进了乳腺癌肿瘤形成。Liu等[10]发现长链非编码RNA SUMO1P3在乳腺癌中表达增加，且可能是通过负调控miR-320a表达，促进乳腺癌的恶性进展；Yu等[11]在乳腺癌细胞中外源性增加miR-320a表达后发现，细胞的增殖、迁移和侵袭能力均被显著抑制，推测miR-320a在乳腺癌肿瘤形成过程中发挥抑癌基因功能。

本研究结果显示，乳腺癌组织中miR-320a表达与患者年龄、绝经状态、ER/PR/HER2表达状态和TNM分期均不相关，而与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移均有关，提示miR-320a表达可能与乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭紧密相关，如Lu等[9]在肝细胞癌中发现，miR-320a表达下降可激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进细胞增殖；在神经胶质瘤中，miR-320a可通过靶向调节AQP4基因表达，进而抑制细胞迁移和侵袭过程[12]；而在鼻咽癌中，增加miR-320a表达，可降低BMI-1基因表达，进而抑制细胞增殖、迁移和侵袭[13]，以上研究均证实，miR-320a具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的功能，且通过调节信号通路活性或基因表达实现。

本研究结果显示，miR-320a高表达者术后5年总生存率高于低表达者，预后较好，提示miR-320a表达可能是乳腺癌患者预后预测的负因子。Yang等[14]证实miR-320a是侵袭性乳腺癌的独立预后靶分子，提示miR-320a可作为乳腺癌患者预后预测的靶标。

综上所述，miR-320a在乳腺癌组织中表达降低，其低表达可能促进了疾病恶性进展、导致患者预后不良。miR-320a可作为乳腺癌病情判断和预后预测的靶标分子。