萋-尼氏抗酸染色法和金胺O荧光染色法在结核分枝杆菌痰涂片检测中的对比

赵 慧 ，王春花 ，孙 蕊 ，谢 彤 ，穆 成 ，王志锐 ，巨韩芳 ，朱 泽

（1.天津医科大学病原生物学系，天津300070；2.天津市结核病控制中心结核参比室，天津300041）

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染性疾病，我国是全球高负担国家之一[1]。结核病的诊断与防治一直是我国结核病控制工作面临的重点。早期快速诊断对于结核病的治疗和预防控制起着重要的作用。结核分枝杆菌分离培养实验耗时较长，使用固体改良罗氏培养基（Lowenstein-Jensen，L-J）培养常常需要20 d～2个月，即使采用较先进的全自动分枝杆菌检测/药敏系统做液体培养也需要7～20 d左右。实验室最常用的方法是痰标本直接涂片法，此法操作简单、价格低廉，但是操作起来比较费时，而基层痰检实验室在涂片量大的情况下1 d之内无法得出结果，这样的现状远远不能满足结核病临床和防治工作的需要。近年来，荧光染色技术得到了飞速发展，作为一种研究方法或实验手段，已被广泛地应用于医学科学领域内各种基础理论研究和临床诊断。目前，金胺O荧光染色也逐渐应用在结核分枝杆菌的痰涂片检测上。本文对传统的萋-尼氏抗酸染色法（简称Z-N）和荧光染色两种染色方法在结核分枝杆菌痰涂片镜检过程中的检测效能进行了初步的比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 580例标本均来自于2012年8-12月天津市结核病控制中心门诊部收取的病人送检痰液。

1.1.2 试剂和仪器 抗酸染色试剂盒和金胺O染色试剂盒，购自珠海贝索生物技术有限公司，LED荧光显微镜（carl ZEISS Primo Star iLED），图像采集系统（ZEN.exe 1.0.1.0），Milli-Q Integral 3（A 10），NUAIR classⅡ生物安全柜（MODEL NO.NU-425-600E），BACTEC MGIT 960 （Becton Dickinson&Company）。

1.2 方法

1.2.1 标本的确认 痰标本排除口水痰后纳入研究范围。确认纳入的当天，每份痰标本取相同位置痰液制成两张涂片。

1.2.2 涂片染色镜检 每份痰样品各涂片2张，分别进行Z-N和荧光染色。染色时，Z-N法复红染色时采用加热5 min，荧光染色采用金胺O冷染15～20 min。镜检时，Z-N法在1000×镜下观察，金胺O法在400×镜下观察。具体的方法及报告标准参见文献[2]。

1.3 阴性对照组实验 用高压灭菌后的磷酸盐缓冲液（PBS pH=6.8）作为样本，制作60张涂片，30张为一组，第一组采用Z-N法涂片，第二组采用荧光染色法涂片。

1.4 分枝杆菌全自动分枝杆菌检测/药敏系统培养 采用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测系统进行样本培养，实验方法及结果判定参照文献[2]。

1.5 读片时间统计 对纳入的580张涂片进行读片时间的记录，统计两种染色法对同一标本各自的读片时间。

1.6 质量控制 所有参与研究的人员都是经过统一培训的实验室技术人员。纳入标本的涂片和镜检，均由同一名实验人员完成。

1.7 统计学处理 两率之间的比较采用χ2检验，两种方法读片时间上的比较采用t检验，P＜0.05即为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Z-N法和荧光染色法与培养结果的比较 580份痰标本抗酸染色法阳性检出率为10.8%，荧光染色法阳性率为15.3%，两种方法比较差异有统计学意义（χ2=5.118，P＜0.05）（表 1，图 1）。

表1 Z-N法和荧光染色法与培养结果的比较Tab 1 ComparisonbetweenZ-Nandfluorescentstainingandculture

图1 两种染色方法及培养阳性数的比较Fig 1 Comparison betweentwostainingmethodsandpositivenumber of culture

2.2 不同检测方法的结果分析 见表2、3。两种染色方法的诊断符合率无统计学差异（χ2=1.917，P＞0.05），见表4；Z-N正确诊断指数（即约登指数=灵敏度+特异度-1）为0.398 7，荧光染色正确诊断指数为0.545 8。

表2 Z-N法与培养的检测结果分析（n）Tab 2 AnalysisoftheresultsofZ-Nandculture （n）

表3 荧光染色法与培养的检测结果分析（n）Tab 3 Analysisoftheresultsoffluorescentstainingandculture （n）

表4 两种染色方法检测对比Tab 4 Comparisonbetweentwostainingmethods

2.3 对每一例标本在两种染色方法中进行分级比较 对每一级别的结果进行χ2检验，结果表明两种染色方法在各阳性分级比较中没有统计学差异（P＞0.05）。另外，在阴性对照组30例中，有1例在荧光染色时，20×物镜下见到两条疑似结核杆菌，在油镜下确认为并非结核杆菌（表5、6）。

表5 实验组Z-N染色和荧光染色结果的分级比较[n(%)]Tab5 ClassificationcomparisonbetweenZ-Nandfluorescentstaining intheexperimentalgroup [n(%）]

表6 阴性对照组Z-N染色和荧光染色的结果Tab 6 Results of Z-N and fluorescent staining in negative control group

2.4 两种方法读片时间比较 观察580张涂片，抗酸染色累计用时2 505 min，平均用时4.32 min/张；荧光染色累计用时1 220 min，平均用时2.10 min/张。两种方法的时间用t检验，结果具有显著的统计学差异（P＜0.01）。可见，荧光染色法的效率远远高于抗酸染色法。见表7，图2～9。

表7 两种染色方法的读片时间分析Tab 7 Analysisofthereadingtimebythetwomethods

图2 荧光染色+（10×40）Fig 2 Fluorescent staining+（10×40）

图3 荧光染色++（10×40）Fig 3 Fluorescent staining++（10×40）

图4 荧光染色+++（10×40）Fig 4 Fluorescent staining+++（10×40）

图5 荧光染色++++（10×40）Fig 5 Fluorescent staining++++（10×40）

图6 抗酸染色+（10×100）Fig 6 Z-N+（10×100）

图7 抗酸染色++（10×100）Fig 7 Z-N++（10×100）

图8 抗酸染色+++（10×100）Fig 8 Z-N+++（10×100）

图9 抗酸染色++++（10×100）Fig 9 Z-N++++（10×100）

3 讨论

随着实验室诊断技术的进步，分子检测技术被更多地运用到痰标本检测中。其中多色巢式荧光定量PCR（Xpert MTB/RIF）无论在灵敏度还是特异度方面都远远高于传统的细菌学检测[3]，但是考虑到明显的成本效益和普及程度，痰涂片镜检在国家结核病控制规划中仍是最有效的病人发现方法，传统的萋-尼氏染色镜检是目前国内主要的镜检方式[4]。不论是从结核病控制、流行病学调查和研究，还是从临床诊疗的角度看，分枝杆菌的分离培养都是结核病病原学诊断的“金标准”[2]。本次研究中，以分枝杆菌培养结果为参照分析，荧光染色灵敏度（57.58%）高于Z-N灵敏度（41.67%），而两种方法的特异度相差不大，诊断符合率也无统计学差异（χ2=1.917，P＞0.05）；在正确诊断指数（即约登指数=灵敏度+特异度-1）方面，荧光染色（0.545 8）要高于Z-N（0.398 7），而约登指数越高，说明筛查实验的效果越好，真实性越大。综合多组实验数据，说明荧光染色法诊断效果优于抗酸染色法。

有文献报道[5]荧光染色法检测痰中结核杆菌的灵敏度高，特异性和准确率也比较高。也有报道称[6]，荧光染色法特异性与抗酸染色法相似，但敏感性平均要高10%，本次实验结果与其相一致。也有报道[7]显示，对于结果为1+的标本，两种染色方法的检出率差异有统计学意义，而对于结果为±，2+,3+,4+的标本，两种方法的检出率无明显差异，表明两者阳性率的差异主要体现在含菌量较少的痰液标本。本实验与其研究并不一致，这可能与本次实验标本收集时间短，数据少有关。

在操作上，抗酸染色法较荧光染色法繁琐，加热时易产生气溶胶。荧光染色镜检抗酸杆菌在暗色背景下会发出橙黄色荧光，醒目易发现。并且荧光染色在20×物镜视野大，镜检速度快，而抗酸染色100×油镜视野小，镜检速度较慢。镜检时间的分析显示，镜检580份涂片，荧光染色法的镜检时间要远远低于抗酸染色法的镜检时间。这对工作效率的提高有着重要的意义。有资料表明，荧光染色的假阳性率可高达5.9%，本研究结果与之相近，在30例阴性对照标本中，其中有1例在荧光染色时，20×物镜下见到两条疑似结核杆菌，在油镜下确认为并非结核杆菌。故对于菌量少的样本，在高倍镜下观察仍为疑似者，要在油镜下再次确认其形态，方可得出结论。另外，实验中造成假阳性可能原因为荧光染色镜检使用的放大倍数（400×）较Z-N法镜检（1 000×）低，所以在菌量少的情况下，加上杂质也会有荧光显色的干扰，镜下对菌体形态不容易辨认[8]。

本研究结果表明，荧光染色镜检的敏感度比ZN法镜检提高15%多，特异度并没有明显降低；另外荧光染色镜检可以明显缩短读片时间，且染色无需加热。所以使用荧光染色法镜检痰涂片，是一种快速、灵敏的检测方法[9-11]。同时，该方法若配套图像采集系统，能更直观的看到菌体情况，为临床诊断和患者提供更快捷、更直接的报告方式。荧光染色法更适用于日工作量较大，并且人员镜检经验丰富的实验室。