一种用于细胞成像检测Al(Ⅲ)的高选择性开关型烟酰肼类荧光探针

张晓梅 ，王冠元 ，韩 静 ，孙予璇 ，李庆忠 ，谢承志

（1.天津医科大学药学院，天津300070；2.天津医科大学肿瘤医院药学部,天津300060；3.烟台大学化学化工学院，烟台264005）

铝是地球上含量最多的金属元素，在生产生活领域中有着广泛的应用，如水处理、食品添加剂、药品、电化学、轻合金的生产等[1-3]。然而，过量的铝会引起人体特定组织和细胞的损害，导致健康问题，如低色小红细胞性贫血、铝相关性骨骼疾病(ARBD)、脑病、痴呆、肌肉病变、阿尔茨海默症和帕金森病等[4-6]。另外，铝离子还会产生生物代谢性的危害，如铝离子会影响体内的钙和硒的吸收代谢[7]。此外，人们认为，世界上近40%的酸性土壤是由铝毒污染的，这是妨碍植物（如农作物）在酸性土壤中生长的关键因素[8]。选择性识别和检测铝离子，对生物学和临床医学等领域的相关研究具有十分重要的意义。荧光探针分析法具有选择性好、灵敏度高以及操作简单等优势，因此设计合成特异性识别铝离子的荧光探针成为近年来的研究热点之一。虽然目前已有的铝离子荧光化学传感器无论是选择性、灵敏性，还是检测限、响应速度，普遍具有较好的理化特性,但是，该类化学传感器往往需要复杂的合成过程，能够通过简单一步反应合成的报道较少。而且，大多数水溶性差，不易在水体系中进行荧光检测，故难以开发细胞成像，不能实现相应荧光探针在细胞层次或者组织层次上进行铝离子的生理、生化行为的研究[9-11]。基于上述发展状况，我们将烟酰肼和羟基萘醛通过缩合反应合成一个席夫碱配体，并研究其在溶液及细胞内的铝离子荧光检测能力。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂 所用试剂均为分析纯，实验用水由Labconco WaterPro水系统制备，烟碱肼(阿拉丁试剂)，2-羟基-1-萘甲醛(安耐吉化学)，硝酸铝(天津市化学试剂六厂)，甲醇(天津市化学试剂六厂)，复方氢氧化铝片 (山西云鹏制药有限公司)，MCF-7细胞（美国ATCC细胞库）

1.2 仪器 RF-5301型荧光分光光度计，Nicolet380傅立叶变换红外光谱仪，Bruker AVANCE III 400 MHz核磁共振波谱仪，LCQ电喷雾质谱仪，尼康Nikon ECLIPSE Ti全自动倒置显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 探针化合物L的合成 参考相关文献[12]，化学反应如图1所示。称取2-羟基-1-萘甲醛1.72 g(10 mmol)置于圆底烧瓶中，用20 mL无水乙醇溶解，称取烟碱肼1.37 g(10 mmol)，用20 mL无水乙醇溶解，置于恒压滴液漏斗中，缓慢滴入圆底烧瓶。设定油浴温度为100℃，加热搅拌回流5 h，反应过程中用TLC检测。反应结束后，抽滤，滤饼再用甲醇重结晶1次，得黄色结晶2.13 g，产率73.12%。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ（ppm）12.60（s，1H，OH-Ar）,12.37（s，1H，-NH-），9.47 （s，1H，=CH），7.24～9.15（m，10H，HAr）.IR（KBr cm-1）：υC=O1 692.3，υ（Schiff-base）C=N1 597.1。

图1 探针分子L的合成Fig 1 Synthesis of probe L

1.3.2 探针化合物L的荧光性质研究

1.3.2.1 灵敏性实验：将5 μL 1.0×10-4mol/L探针化合物L加入到2 mL甲醇，Tris-HCl缓冲溶液为9∶1混合溶剂的样品池中（终浓度为2.5×10-7mol/L），然后逐渐加入1.0×10-5mol/L硝酸铝的甲醇溶液（每次5 μL），测试荧光光谱。

1.3.2.2 选择性实验：2.5×10-7mol/L探针L溶液，分别加入 K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+、Al3+溶液（K+、Ca2+、Na+、Hg2+的浓度是L浓度的50倍，Cd2+、Mn2+的浓度是L浓度的10 倍，Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的浓度是 L 浓度的5倍，Al3+的浓度是L浓度的1倍），待金属与L充分反应后，测试荧光光谱。

1.3.2.3 Job’s-Plot方法确定L与A13+结合的配位比：保持配体L与Al3+的总浓度不变（终浓度为5×10-7mol/L），改变配体L与Al3+摩尔比测定其荧光强度值。

1.3.3 细胞成像实验 乳腺癌细胞（MCF-7）培养借鉴于美国标准菌库ATCCHB-8065，通过含体积分数10%胎牛血清（FBS）的完全培养基进行传代培养。使用倒置荧光显微镜拍摄加入铝离子前后的细胞荧光成像。

2 结果

2.1 探针L的荧光性能研究

2.1.1 灵敏性 在甲醇：Tris-HCl缓冲溶液为9：1的混合溶剂中，配体L与加入的不同浓度的硝酸铝溶液充分反应后，在波长为409 nm的光激发下进行荧光光谱测试。从图2可以看出，随着Al3+的加入，L可产生显著的荧光增强趋势，并随着铝离子的浓度增大而增强，最大发射峰位于458 nm和480 nm处。此外，铝离子浓度在0～0.3 μmol/L范围内与荧光强度保持了良好的线性关系。以I/I0→1对[Al3+]作图，根据IUPAC对于检测限的定义，根据公式DL=K×Sb1/S（K取3，Sb1为空白溶液的标准偏差，S为校准曲线的斜率）计算，能得到配体检测金属离子的最低浓度，即配体L对金属离子的检测限为 2.3×10-9mol/L。

图2 探针分子L在甲醇/Tris-HCl混合溶剂中的Al3+荧光滴定谱图Fig 2 Fluorescence emission changes of L in methanol/Tris-HCl solution upon the addition of increasing amount of Al3+

2.1.2 选择性 配体L与加入的不同金属离子充分反应后，进行荧光性质考察。以波长409 nm光源为激发光，测得荧光强度变化情况如图3所示。可以看出，配体探针L加入不同金属离子的荧光强度变化不同，虽然其它各种金属离子在溶液中浓度显著高于配体探针 L（K+、Ca2+、Na+、Hg2+的浓度是 L浓度的50倍，Cd2+、Mn2+的浓度是L浓度的10倍，Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的浓度是 L 浓度的 5 倍，Al3+的浓度是L浓度的1倍），加入其它常见金属离子充分反应后，配体L荧光强度没有较大改变；加入Al3+时，配体L响应非常明显，由此确定荧光探针L对铝离子具有较好的选择性。

图3 探针分子L在甲醇/Tris-HCl混合溶剂中，加入不同金属离子的荧光光谱(λex=409 nm)Fig 3 Fluorescence spectra of probe L in the presence of various metal ions in methanol/Tris-HCl solution(λex=409 nm)

2.2 L与A13+结合配位比的确定 了解金属离子与有机配体间的配位比例，可以为确定配合物的结构及阐明荧光增强的机理提供重要信息。保持配体L与Al3+的总浓度不变（5×10-7mol/L），Al3+的浓度占总浓度的比例在0～1之间变化，通过绘制荧光强度与相应Al3+所占浓度比值的线性曲线，拟合得到L与Al3+络合的配位比，得到如图4所示的结果。由Job’s plot曲线可以看出，当[Al3+]/[Al3++L]的比值在0.33左右，即Al3+与L的配比为1：2时荧光强度达到最高点，因此可以推测出，铝离子结合两个配体形成配合物。为了进一步确定A13+与L的结合方式，采用ESI-MS谱对Al3+-L形成的复合物进行了表征。质谱中出现的强峰（m/z 607.2），其对应的结构为[Al（L）2]+（calcd m/z 607.2）。

2.3 细胞成像研究 给药配体设置为10 μmol/L，溶液为PBS缓冲溶液，给药1 h后显微镜下观察拍照。拍照完成后，再往配体组加入15 μmol/L的Al（NO3）3，给药1 h后观察拍照。由图5可以看出，在细胞中外加Al（NO3）3后，可以观察到非常明显的荧光现象，表明探针分子可进入细胞检测过量的铝离子。

图4 探针分子L与Al3+的荧光Job's plot曲线(λex=409 nm)Fig 4 Job plot of probe L with Al3+based on fluorescence spectra

图5 探针分子L在乳腺癌细胞（MCF-7）中的细胞成像图Fig 5 Fluorescent imaging of probe L in MCF-7 cells

2.4 量化计算 用Gaussian 09程序包[13]，采用密度泛函理论（DFT），在 B3LYP 水平用 6-31+G（p，d）基组，对探针分子L和形成的2∶1配合物进行构型优化。优化的分子结构见图6，可以看到萘环上羟基的氢原子和C=N双键上氮原子的距离为1.828Å，O-H…N角度为142.5°，形成分子内氢键，符合激发态分子内质子转移（ESIPT）机制。L及其铝配合物的前线分子轨道图见图7，最高占据轨道HOMO的能量分别为-5.899 eV和-7.719 eV，最低空轨道LUMO的能量分别为-2.372 eV和-5.398 eV，说明配合物具有更好的热稳定性。L和配合物的HOMO电子云主要集中在羟基取代的萘环上，而LUMO的电子云分布在整个分子，符合分子内电荷转移（ICT）机制。

图6 探针分子L的优化构型图Fig 6 Optimized structures of probe L

图7 探针分子L与AlL2配合物的HOMO和LUMO轨道能级图Fig 7 Views of HOMO and LUMO of probe L and AlL2

3 讨论

本文合成了一种烟酰肼席夫碱荧光探针，其合成原料便宜，制备简便，结构通过红外谱图和核磁谱图得以确认。光谱研究显示，探针L在甲醇-水缓冲溶液中对Al3+具有良好的选择性，其检测限可达到纳摩尔级别，通过质谱和Job’s plot曲线可确定探针分子L与Al3+形成2∶1的稳定络合物。该探针对Al3+的响应可以归于ESIPT机制[14]和ICT机制[15]，并通过量化计算证明。探针分子羟基的氢原子和C=N双键上氮原子形成分子内氢键，存在激发态分子内质子转移(ESIPT)现象，加入铝离子后，发生去质子化作用，抑制了探针分子的ESIPT进程，因而荧光增强。分子具有较大的极性和明显的分子内电荷转移(ICT)效应，与铝离子结合后对荧光团的推-拉电子作用产生影响，从而导致荧光光谱的变化。由于探针分子在水体系下也可以发射出很强的荧光，因此可用于检测药物及生命体系的铝离子含量。本实验制备的新型探针L是一种灵敏度极高并具有很强选择能力的Al3+荧光探针，有望应用于生物医药领域。