反相液相色谱法对米糠油中四种生育酚含量的测定

李晴 周晓晴 陈沙 喻俊磊

摘要：建立了反相液相色谱法同时测定植物油中4种生育酚的方法。样品用甲醇超声提取，离心后取上清液氮吹至干，甲醇定容后过有机相滤膜，PEF柱（150 mm×3.0 mm，2.6 μm）分离，甲醇∶水（88∶12）作流动相等度洗脱，流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；荧光检测（λex=294 nm，λem=328 nm）進样5 μL，外标法定量，在20 min内同时分离出α-、β-、γ-和δ- 4种生育酚异构体。4种生育酚的质量浓度在0.5～50.0 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数大于0.999。在3个添加水平下的平均加标回收率在84.47%～116.50%，相对标准偏差≤6.0%（n=6），α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚及δ-生育酚的方法检出限分别为0.10、0.05、0.05、0.04 mg/kg，表明该方法灵敏度高，回收率好，可应用于实际样品的分析。

关键词：反相高效液相色谱；荧光检测；生育酚；米糠油

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.021

Abstract： The method of simultaneous determination of 4 kinds of tocopherol in vegetable oil was established by reversed-phase liquid chromatography.After sample ultrasonic extraction with methanol，centrifugal supernatant liquid nitrogen blow to dry，the capacity after the methanol organic phase filter membrane，PEF column（150×3.0 mm，2.6microns） separation，methanol and water （88∶12） elution flow equal degree，velocity 0.4 mL/min；Column temperature 30 ℃；The fluorescence detection （a） of the sample volume was 5 μL，the external standard method was quantitatively determined，and the two types of paroxygenol isomers were isolated at the same time in 20 min. The mass concentration of 4 kinds of tocopherol was in a good linear relationship with the peak area within the range of 0.5～50.0 μg/mL，and the linear correlation coefficient was greater than 0.999. Adding in the three levels with respect to the average recovery was 84.47%～116.50%，relative standard deviation（RSD） for 6.0% or less（n=6），alpha tocopherol，beta tocopherol，gamma tocopherol and delta-tocopherol，method detection limit （LOD） were respectively 0.10，0.05，0.05，0.04 mg/kg. The method is accurate，sensitive and reliable，and can be applied to the analysis of actual samples.

Key words： inverse phase high performance liquid chromatography； fluorescence detection； tocopherol； rice bran oil

生育酚（Tocopherol）俗称维生素E，是人体代谢所必需的一种植物源性脂溶维生素，室温下为油状液体，橙黄或淡黄色，在热、酸等环境比较稳定，遇碱不稳定，易氧化。根据甲基的数目和位置的不同分为α-、β-、γ-和δ- 4种不同形式（结构式见图1）。4种生育酚的生物活性强度不同，如α-生育酚分布最广、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最强。生育酚对人体有重要的生理功能，具有抗氧化、抗衰老、抗不育、调节免疫力等作用，对生殖功能、细胞代谢均有影响[1]，对一些临床疾病有积极的预防作用。植物油中含有丰富的生育酚[2-5]，但不同植物油中生育酚的种类和含量有所不同。橄榄油、葵花子油、葡萄子油主要含有α-生育酚，核桃油、菜子油、亚麻子油、玉米油、大豆油中主要为γ-生育酚，另外大豆油中含有相对较高的δ-生育酚，米糠油含有最齐全的4种维生素E组分[6，7]。在发达国家，米糠油是一种与橄榄油齐名的健康营养油，深受高血脂、心脑血管疾患人群喜爱，并早已成为西方家庭的日常健康食用油，随着中国稻米精深加工业整体水平的提高，以及人们对油类产品的营养保健作用的重视，米糠油的产业链正在逐步形成，其市场潜力将逐步释放，由于米糠油本身稳定性良好，适合作为煎炸用油，还可制作人造奶油、起酥油以及高级营养油等。选用米糠油作为研究对象，并对生育酚在煎炸过程中的稳定性进行研究。

目前食品中生育酚测定常用的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法（Highperformance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱法（Gas chromatography，GC）及傅里叶变换红外光谱法（Fourier transform infrared spectrometry，FTIR）等。其中，應用最广泛的为高效液相色谱法，包括正相液相色谱法[8-10]和反相液相色谱法[11-15]。新国标GB 5009.82-2016[16]与GB/T26635-2011[17]均采用正相色谱法测定α-、β-、γ-及δ-生育酚，但是正相高效液相色谱法有许多缺点，如流动相挥发性强、一些溶剂强致癌性、重复性差、分析时间长及稳定性差等，加之正相液相色谱在应用上不如反相色谱广泛。故有必要建立一种反相液相色谱的分析方法用于4种生育酚检测。

1 材料与方法

1.1 样品材料

米糠油（市售）。

1.2 试剂

生育酚标准品：α-生育酚（纯度99.9%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；β-生育酚（纯度95.2%，BePure）；γ-生育酚（纯度94.6%，BePure）；δ-生育酚（纯度95.2%，SUPELCO）。

甲醇、正己烷（SCHARLAB S.L公司）均为色谱纯；试验用水为超纯水。

1.3 仪器与设备

高效液相色谱系统（美国戴安公司）；离心机（德国Sarorius公司）；恒温氮吹仪（江西华科精密仪器有限公司）；振荡器（上海爱朗仪器有限公司）；超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（精度为0.000 1 g，德国Sarorius公司）。

1.4 方法

1.4.1 生育酚标准储备液 准确称取生育酚标准品50 mg于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液溶解后，定容至刻度，得到1 000 μg/mL的标准储备液，-20 ℃避光保存，临用前校正。

1.4.2 生育酚标准工作液 分别移取不同体积中间工作液到50 mL棕色容量瓶，用乙醇定容至刻度，稀释配制浓度为0.500、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL的系列标准工作液，临用前校正。

1.4.3 样品前处理 称取0.50 g植物油样于50 mL离心管中，加入10.00 mL甲醇，振荡提取10 min，以4 000 r/min离心5 min，取5.00 mL液体，避光氮吹干，用1.00 mL甲醇定容，过0.25 μm有机相滤膜，待测。

1.4.4 标准曲线的绘制 分别将“1.4.2”中系列标准工作液按试验方法进样，记录得到的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.5 色谱条件

PEF色谱柱（150 mm×3.0 mm×2.6 μm），柱温为室温，甲醇-水（88∶12）作流动相等度洗脱，流速0.4 mL/min，荧光检测（激发波长为294 nm、发射波长为328 nm）进样量5 μL。

2 结果与分析

2.1 方法的优化

2.1.1 提取条件的优化 采用正相液相色谱法测定食品中的生育酚，前处理简单但是进样过程繁琐、耗时长且重复性较差，本方法采用甲醇和乙腈进行反相液相色谱法提取和分析，结果显示用甲醇做为溶剂进行提取时提取率较高且样品图谱无干扰性杂峰（图2）。为了获得更好的提取率，对甲醇的提取体积进行考察，其回收率见图3。其中用10 mL甲醇作为萃取溶剂时，萃取率最高。因此，选择10 mL的甲醇做溶剂。

2.1.2 检测器的选择 对比荧光检测器与紫外检测器对生育酚的灵敏度（图4），结果表明荧光检测器对生育酚的灵敏度更强。

2.2 线性关系考察

2.2.1 生育酚标准曲线 将α-、β-、γ-及δ-生育酚系列标准工作液进高效液相色谱仪进行测定，结果见表1。结果表明，δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚在0.1～50.0 μg/mL，α-生育酚在0.5～50.0 μg/mL具有良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 对同一样品进行6次重复进样，δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和α-生育酚相对标准偏差结果见表2。

2.2.3 回收率试验 对米糠油样品进行3个添加水平的加标，按照“1.4.3”中的方法处理后进高效液相色谱仪，高、中、低回收率见表3。4种生育酚的加标回收率在84.47%～116.50%，表明该方法回收率良好，结果准确。

2.3 样品稳定性测试

对不同煎炸时间米糠油的含量进行测定，结果见表4。由表4可以看出，煎炸米糠油中各种生育酚含量随煎炸时间的延长而降低，至煎炸32 h，生育酚含量基本丧失，仅存微量的α-生育酚。

3 结论

本研究建立了反相高效液相色谱法同时测定米糠油中4种生育酚的分析方法，该方法操作简单、线性良好、稳定性好及回收率满足分析要求且该方法中4种生育酚的检出限及定量限均低于国家标准GB5009.82-2016规定的检出限要求，既节约了成本又节省了时间，因此该方法可用于实际样品的检测。

随着油炸时间延长，4种生育酚的活性明显降低，而地沟油是由植物油经高温煎炸反复使用后得到，因此可将生育酚含量作为地沟油筛选的指标之一。

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