慢病毒介导MCF—7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立

谭拥军 郭明月 向勤 李谕

摘 要：为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达，采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体，并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞，包装shFOXP2干扰慢病毒，收取病毒上清加入到MCF-7细胞中，培养48 h，荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平，Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体，从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株，为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.

关键词：FOXP2；慢病毒载体；RNA干扰；乳腺癌MCF-7细胞

中图分类号：U44文献标志码：A

Abstract：In order to establish a MCF-7 cell line with lentivirus-mediated FOXP2 gene silencing and confirm its interference effect， the lentiviral vector （pMAGic7.1-shFOXP2） was constructed by genetic engineering and cotransfected with pVSVG、Δ8.91 into HEK293T cells， which generated the mature lentivirus， viral supernatant was collected and added to MCF-7 cells after 48 h， the mRNA and protein levels of FOXP2 were examined by qPCR and Western blot. Thus， we constructed and identified the lentiviral recombinant vector pMAGic7.1-FOXP2，successfully established a MCF-7 cell line with the interference of FOXP2 expression， as these findings imply a promising strategy for studying FOXP2 functions in breast cancer progression.

Key words：the forkhead box p2； lentivirus vector； RNA interference； breast cancer MCF-7 cells

FOXP2基因位于7号染色体短臂31区域，属于FOX转录家族.叉头框蛋白（forkhead box）家族是一类具有广泛功能的转录因子家族，它的DNA结合区是一个特殊的翼状结构，即螺旋转角螺旋蛋白结构，并且在生物进化中高度保守，此结构由100个氨基酸组成，包含3个α螺旋、3个β折叠以及2个大环结构[1].FOXP2蛋白包含一个谷氨酸富集区、一个FOX叉头框DNA结合区和一个由50个氨基酸组成的高度保守的N端，在N端能够形成锌指或亮氨酸拉链结构，这种结构是FOXP2与FOXP1 和 FOXP4 相互作用形成同源二聚化與异源二聚化所必需的 [2-3].FOXP2转录后可剪切形成18种转录本，经过生物信息学和蛋白结构分析，预测出FOXP2下游靶基因结合基序5-CAAATT-3[4].FOXP2主要在胚胎发育、细胞分化和肿瘤的上皮间质转化过程中发挥着重要的功能.

FOXP2（forkhead box p2）最早发现与控制语言能力发展相关，通过研究发现，FOXP2第553位的精氨酸突变为组氨酸（R553H）能够引发严峻的先天性语言障碍疾病，并且FOXP2 的缺失或者突变可能引发语言障碍及运动神经元系统紊乱[5-6].除此之外FOXP2在多种肿瘤细胞中表达与肿瘤的EMT发生发展有密切的关系，大量研究数据已经表明在骨肉瘤[7-9]、肝癌[10-12]、胃癌[13-14]可以抑制肿瘤转移的发生发展.Dung-Tsa[15]等发现FOXP2基因及蛋白存在于人的正常组织和乳腺癌组织中，并在具有侵染性的乳腺中的表达被抑制，但对于FOXP2如何调控乳腺癌发生发展的机制研究尚不清楚.因此，研究乳腺癌细胞中FOXP2转录因子调节EMT相关基因的分子机制，对认识乳腺癌细胞的转移并确认抑制靶点具有重大价值.

对于细胞转染有多种方法，包括脂质体转染、磷酸钙转染、腺病毒感染和慢病毒感染，相比其它转染方法而言，脂质体转染和磷酸钙转染最为常见，但其转染效率会因细胞种类的不同而有所差异，并且脂质体的成本较高.生物实验中所用到的慢病毒载体大部分是以HIV为基础、人为改造的基因治疗载体，它的感染能力与细胞种类关系不大，感染的时候对细胞所处的生长时期没有特别的要求.只需要将目的基因片段连接到慢病毒载体中，目的基因会随着病毒基因的复制而复制，包装成新的病毒感染宿主细胞，被整合到宿主细胞的基因组上.由于辅助质粒不能被包裹于新的病毒内，所以病毒包装完成后，只具有感染细胞的能力，而不能在宿主细胞内再次形成新病毒，不会使宿主细胞裂解死亡，提高了生物安全性，大大节约成本[16-17].

本文应用慢病毒的方法构建了FOXP2基因沉默的MCF-7稳定表达细胞株，为以后乳腺癌的临床治疗提供良好的素材和工具.

1 材料和方法

1.1 细胞和材料

HEK293T细胞、乳腺癌MCF-7细胞本实验室储存；DH5α感受态细胞购于takara公司；慢病毒载体pMAGic7.1、pVSVG、Δ8.91均来自于上海生博医学生物工程科技有限公司.

1.2 主要试剂和仪器

1Kb DNA Ladder marker、marker2均购自于广东东盛科技公司；双色蛋白预染蛋白marker购自生工生物工程上海有限公司；蛋白核酸分析仪来自于Eppendorf 公司；胰酶、DMEM培养基来自于GIBCO公司；FBS购自Hyclone公司；PVDF购自Millipore公司；PBS购自北京鼎国公司；过硫酸铵（APS）、十二烷基磺酸钠（SDS）购自Sigma公司；FOXP2抗体购自cell signaling technology（CST）公司；Rabbit二抗购自GE公司.

1.3 方 法

1.3.1 细胞培养

HEK 293T细胞和MCF-7细胞均用含10%的FBS和1%双抗（含100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素）的DMEM完全培养基进行培养，放置在37 ℃、5%浓度CO2、90%相对湿度的细胞培养箱中进行培养，等细胞达到平台期后进行传代，当HEK293T细胞密度达到80%可以进行磷酸钙转染.

1.3.2 干扰序列的获取

查询文献[12]获得FOXP2干扰序列，如表1.

1.3.3 pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒载体的构建

将合成的干扰序列用1×TE buffer溶解成20 μM，互补的单链各取30 μl混合，混合后的产物放入水浴锅中95 ℃加热5 min，然后将水浴锅关闭，开盖，在室内自然冷却，使干扰序列互补配对形成双链，取1 μl做后面连接使用，剩余的-20 ℃储存.经AgeI/EcoRI双酶切后对线性化的载体pMAGic进行胶回收，获取酶切产物，取退火后双链DNA序列1 μl，2.5 μl酶切后的干扰载体，10×T4 DNA ligase buffer 2 μl，T4 DNA ligase 1 μl，ddH2O 13.5 μl，21 ℃连接40 min.将2 μl酶连产物加入到20 μl的感受态细胞中，冰上静置30 min，再将EP管迅速放入42 ℃水浴锅中热激90 s，冰上冷却2 min，然后加入500 μl LB培养基，放入摇37 ℃，220 r/min活化细菌1 h，此后吸取适量的细菌转化液进行涂板（含有Amp的LB固体培养板），在37 ℃细菌培养箱中倒置培养12～16 h.

1.3.4 shFOXP2慢病毒载体的鉴定

每个培养板分别挑取4个单克隆菌落进行菌落PCR鉴定，5通用引物5-AGCGGATCTGACGGTTCACT-3，3引物分別为Control 3AATTCAAAAAAAACACCGTTCGAGACACGATCT

CTTGAGTCGTGTCTCGAACGGTGTT；shFOXP2#2 3AATTCAAAAAAAACTTGGAAGAATGCAGTATCTCTTGAGTACTGCAT

TCTTCCAAGTT；shFOXP2#4 3AATTCAAAAAAAGCAAACAAGTGGATTGAATC

TCTTGAGTTCAATCCACTTGTTTGCT；用1%琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR扩增后的产物，选取阳性克隆送入生工生物公司进行测序鉴定.

1.3.5 磷酸钙转染与shControl、shFOXP2慢病毒的包装和感染

当HEK293T的细胞密度达到80%左右，就可以进行转染实验，需加样体系如下pMAGic-Control、pMAGic7.1-shFOXP2#2和pMAGic7.1-shFOXP2#4质粒各12 μg，分别加入pVSVG质粒6 μg，Δ8.91质粒9 μg，2M CaCl2 132 μl，补水至1 ml；2×HBS 1 ml；将上述物质进行混合，吹打70～100次，直到出现乳白色，在室温静置20 min后缓慢加入293T细胞中，8 h后进行细胞换液，换液前用1×PBS洗一遍，然后加入含有10%FBS的DMEM新鲜培养基.钙转48 h和96 h后分别收取培养皿中的培养基，用0.45 μm的过滤头进行过滤，去除细胞碎片，获得慢病毒溶液.选取生长状态良好的MCF-7细胞，将对照病毒和shFOXP2慢病毒加入其中进行感染，培养48 h后换取新鲜培养基，观察感染效果，进行扩大培养.

1.3.6 MCF-7中shFOXP2干扰效果的鉴定

获取MCF-7细胞，1×PBS洗两遍，刮取细胞进入2 ml EP管中，4 ℃离心 1 000 r/min，5 min，加入合适体积的RIPA裂解液，按1∶100的比例加入蛋白酶抑制剂，冰上放置1 h，再12 000 r/min，4 ℃离心，15 min，上清即为所需的蛋白溶液，用蛋白核酸分析仪测量蛋白浓度，此后用Western Blotting实验进行检测.

2 结 果

2.1 pMAGic7.1-control、pMAGic7.1-shFOXP2#2和4慢病毒干扰载体的构建和鉴定

插入干扰序列的片段较短，酶切结果不明显，我们根据pMAGic7.1载体的基因序列，在5端位置设计引物，预测PCR结果为700 bp大小.首先挑选12个单菌落，进行菌落PCR后经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，除了11号其余长度大小均为700 bp，无杂带，从每组干扰转化菌液中分别挑取两对送去生工生物公司进行测序，经对比测序结果表明目的基因已成功插入慢病毒载体.

2.2 慢病毒载体的包装和感染

在慢病毒包装和转染之前，首先观察HEK293T（图2A）和MCF-7（图2B）的细胞形态和生长状态.选取生长密度约80%左右的HEK293T细胞，再将pMAGic7.1-control、pMAGic7.1-shFOXP2#2和4载体分别和辅助质粒pVSVG和Δ8.91共同转染HEK293T细胞， 48 h后在荧光倒置显微镜下观察发现有绿色荧光，见图3，说明所构建的质粒转染成功并正常表达.选取生长状态良好的MCF-7细胞，细胞形态如图2B，将上述慢病毒溶液用0.45 μm的过滤头进行过滤，除去细胞碎片，分别感染正常的MCF-7细胞，培养48h后换取新鲜的培养基，并在显微镜下观察有绿色荧光的出现，见图4，说明慢病毒感染成功.

2.3 shFOXP2慢病毒干擾载体表达产物的鉴定

收集上面三种MCF-7细胞株进行qPCR分析和Western blot检测，见图5，结果表明，FOXP2基因在mRNA水平较对照组显著下降，在蛋白表达水平发现FOXP2的表达也有明显下降，由此说明我们已成功得到了低表达FOXP2的MCF-7细胞株.

3 讨 论

目前，在基因治疗方面慢病毒的应用比较广泛，它相对于腺病毒而言，无论细胞是否处在分裂期都对其具有感染能力[18-19]，对一些不分化的细胞、干细胞和癌细胞与脂质体转染相比可以大大提高转染效率，节约成本.普通质粒介导的shRNA持续时间比较短，不能整合到宿主的基因组中，不利于后续实验的进行，本实验运用目的载体和辅助质粒共同转染形成完整的病毒，此病毒在成功感染宿主细胞后，就会丧失感染其他的细胞的能力，促使目的基因在宿主细胞中能够稳定表达.Pfeifer等[20]利用慢病毒与RNAi相结合的技术，将shRNA导入小鼠的受精卵中，获得特定基因敲出的转基因小鼠，应用于某种基因的功能性研究.

绿色荧光蛋白（GFP）最早是由下村修等人于1962年在水母中发现的，分子量为26 KD，含有238个氨基酸[21-22]，其基因所表达的蛋白质，在蓝色波长范围的激发下，发出绿色萤光，可与目的基因构于同一表达载体，在细胞内进行合成时无需复杂的翻译修饰就能成功表达.慢病毒干扰载体中的GFP基因在细胞中能够随着目的基因的表达而稳定表达，易于在荧光显微镜下观察，并且不影响目的基因的表达和功能，可以作为一种标记基因，示踪肿瘤细胞中某种基因的位置及量的变化，Hoffman[23]曾经利用GFP导入肿瘤细胞建立多种动物移植瘤模型，可以动态、直观的观察药物对肿瘤的影响，为药物评价和肿瘤基础治疗提供良好的肿瘤模型.本文中通过建立FOXP2基因沉默稳定表达细胞株，使此细胞株在药物筛选和肿瘤转移示踪中发挥重要作用，为探讨FOXP2基因沉默后对肿瘤发生发展的分子机制提供理论基础.因此，利用稳定的MCF-7细胞株进行小动物活体实验，并通过小动物成像系统持续、直观的观察乳腺癌的生长和转移情况，为乳腺癌后期的个体化治疗提供更为科学的依据和精确的预后评估.

综上所述，我们运用基因工程的方法成功构建了FOXP2基因沉默的慢病毒质粒pMAGic7.1 -shFOXP2，并将其分别与辅助质粒pVSVG和Δ8.91共转染HEK293T细胞，取病毒上清成功感染了MCF-7细胞株，成功获得了能稳定干扰FOXP2表达的乳腺癌MCF-7细胞株，为后期研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了很好的研究材料.

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