Hedgehog和NF—κB信号通路在结核分枝杆菌感染Ⅱ型肺泡上皮细胞中的免疫调控作用初探

杜军 任奇杰 王媛 王娟 李勇

摘要：探讨结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染Ⅱ型肺泡上皮细胞（Alveolar epithelial typeⅡcells，AECⅡ）的免疫应答过程中，Hedgehog与NF-κB信号通路及炎症细胞因子的表达变化规律。利用结核分枝杆菌BCG（Bacillus Calmette-Guérin，BCG，卡介苗，弱毒株）和H37Rv（国际标准强毒株）株分别感染人AECⅡ细胞株A549，利用qPCR和Western blot检测Hedgehog信号通路以及NF-κB信号通路相关因子和炎症细胞因子的表达变化。结果表明，H37Rv和BCG感染A549细胞后，Hedgehog信号通路中Shh、Ptch和Gli1与NF-κB信号通路中p-NF-κB mRNA的表达水平升高，同时，伴随着炎症细胞因子IL-8和TNF-α mRNA的表达水平也升高。并且，H37Rv感染A549细胞引起信号分子Shh、Ptch、Gli1和NF-κB蛋白的表达水平高于BCG。Mtb感染AECⅡ细胞都能激活Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路并促进细胞的炎症因子分泌，强毒株感染对信号通路的活化强于弱毒株。

关键词：结核分枝杆菌；肺泡上皮细胞；Hedgehog；NF-kappaB；炎症因子

中图分类号：S855.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0070-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.017

Abstract： In order to investigate the roles of expression of Hedgehog and NF-κB signaling pathway signal molecules and inflammatory cytokines in the alveolar epithelial typeⅡ cells （AECⅡ） infected with Mycobacterium tuberculosis（Mtb），the human AECⅡ cell line A549 was infected with Bacillus Calmette-Guérin（BCG，attenuated strain） and H37Rv （international standard virulent strain） respectively，and the signal molecules of Hedgehog and NF-κB signaling pathway and inflammatory cytokines in A549 cells of immune response to Mtb was detected by qPCR，and Western blot. The results showed that， the expression of Shh，Ptch and Gli1 in Hedgehog signaling pathway and the phosphorylation of NF-κB in NF-κB signaling pathway was increased in A549 cells when infected with H37Rv and BCG，and at the same time，the expression of IL-8 and TNF-α was also upregulated. And the protein expression of Shh，Ptch，Gli1 and NF-κB in A549 cells infected with H37Rv was higher than that infected with BCG. The Hedgehog and NF-κB signaling pathway could be activated， and the expression of inflammatory cytokines could be promoted in AECⅡ cells when infected with Mtb. The activation level of the both signaling pathway infected with Mtb virulent strain was higher than that of infected with BCG strain.

Key words：Mycobacterium tuberculosis；alveolar epithelial cells；Hedgehog；NF-kappaB；inflammatory cytokines

肺結核（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性、消耗性人兽共患传染病。2014年，全球死于结核病的人数为150万，新发病例近960万。全球54%的结核病例出现在中国、印度、印度尼西亚、尼日利亚与巴基斯坦等国，WHO估算中国2014年的新发肺结核人数为93万，位居全球第三位。由于人畜结核病的交叉感染以及多耐药结核菌株的出现，导致结核病的防治难度增大，并且结核病的人兽疫情在世界部分国家和地区发病隐患日趋严重[1，2]。虽然从Mtb发现到现在已有130多年的历史，但是结核病的发病机制与机体免疫调控机理尚未阐明[3]。

在过去20年中，分泌蛋白Shh（sonic hedgehog）被认为是一种调节胚胎发育及气道和肺泡隔室组织中上皮-间质细胞相互转化的关键因子[4]。近年来对于Shh信号通路在机体免疫调节方面的关注程度越来越高，其在机体免疫反应中的作用也备受关注，越来越多的证据证明在许多成年个体的肺部疾病如肺纤维化、哮喘、肺癌及慢性肺部炎症疾病中都有Shh信号的激活[5，6]。在Mtb感染细胞时Shh信号通路会被激活，但是对强弱毒株感染细胞时Shh信号通路的表达变化尚缺乏系统的研究。另一方面，NF-κB作为一类重要的核转录因子，可调控细胞对不同外界刺激做出合适的细胞信号应答，这种调控作用依赖NF-κB与多种信号通路相互链接的上下游协同作用，NF-κB信号通路与Shh信号通路有关联[7]。为此，试验将基于以上研究结果，用Mtb感染AECⅡ细胞，分析Hedgehog和NF-κB信号通路相关因子及炎性因子的表达变化，探究在AECⅡ细胞受到Mtb感染时Hedgehog和NF-κB信号通路及其在细胞的炎症应答过程中的变化规律，旨在为揭示结核病的发病机理和防控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和细胞 卡介苗（BCG），购自成都生物制品研究所；结核分枝杆菌强毒株（H37Rv），由宁夏回族自治区第四人民医院检验室提供；人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞，购自中国科学院北京协和细胞库。

1.1.2 主要试验试剂 RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清和SuperSignal West Pico Trial Kit（Thermo），Trizol（Invitrogen），反转录试剂盒（Promega），Real Time PCR试剂盒（Qiagen），考马斯G-250和Tween-80（Sigma），Middlebrook 7H9（BD），6×Protein Loading Buffer（全式金），Acr-Bis 30%和Tris-HCl Buffer（上海百赛），改良罗氏培养基（青岛海博），Western BrightTM ECL（Advansta），全面蛋白提取试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒（凯基），ELISA试剂盒（欣博盛），Shh（CST，CST#2207），p-NF-κB（CST，CST#3033），Ptch（Proteintech，17520-1-AP），Gli1（Proteintech，25733-1-AP），β-actin（中山金桥， TA-09），羊抗兔IgG-HRP（中山金桥，ZB-2301），山羊抗小鼠IgG-HRP（中山金桥，ZB-2305），Middlebrook OADC Enrichment（BD）等。

1.1.3 引物 试验所使用荧光定量PCR的引物按照荧光定量PCR引物设计原则进行设计，并在Invitrogen公司合成，详见表1。

1.2 BCGD毒株和H37Rv的培养

挑取健康的BCG和H37Rv单菌落菌株接种于BD 7H9液体培养基，培养3～4周后，可观察到菌体生长导致的培养基浑浊现象。

BD 7H9液体培养基配方为0.47 g BD 7H9+89.8 mL ddH2O+0.2 mL Tween-80，121 ℃ 高压灭菌30 min，使用前加入10 mL Middlebrook OADC Enrichment，混匀、分装。

1.3 BCG和H37Rv感染A549细胞

用胰酶消化A549细胞，用RPIM 1640完全培养基稀释成2.5×105个/mL的细胞悬液，2 mL/孔接种于六孔细胞培养板，体积分数5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养；当A549细胞汇合率达到60%时换培养液，用1640完全培养液重悬BCG和H37Rv，以感染复数MOI（multiplicity of infection，细菌数与细胞数的比例）10∶1分别进行感染，同时，设空白对照。

1.4 Realtime-qPCR检测Hedgehog和NF-κB信号通路相关分子及炎症细胞因子在mRNA水平的表达变化

用BCG和H37Rv感染的A549细胞24 h后收集细胞并提取总RNA，反转录并利用荧光定量PCR技术检测Hedgehog和NF-κB信号通路中相关分子和炎症细胞因子的表达情况（表1）；按照Trizol试剂说明书裂解细胞提取mRNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用Nanodrop 1000（Thermo）紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度；参考Promega反转录试剂盒说明书进行反转录PCR；参照天根公司的荧光定量PCR试剂盒说明书进行荧光定量PCR检测。

1.5 Western Blot检测Hedgehog和NF-κB信号通路中相关因子在蛋白水平的变化

按照全蛋白提取试剂盒说明书（凯基）提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量；进行SDS-PAGE，每孔蛋白上样量为20～30 μg，电压80 V。将SDS-PAGE结果40 mA恒定电流转膜过夜；将PVDF膜放入杂交盒并加入封閉液15 mL，室温，匀速摇床上缓慢摇动封闭1 h；倒掉封闭液，加入稀释好的一抗，4 ℃下在摇床上缓慢摇动孵育一晚；次日用15 mL的TBST缓冲液洗膜，每次摇动洗涤10 min，共洗3次；将二抗按1∶1 000（二抗：5%BSA溶液）的比例稀释加入，室温下摇动1～2 h后用15 mL的TBST缓冲液洗膜3次；用PBS漂洗2次，将配制的ECL显色液滴加到PVDF膜上，室温反应5 min，用保鲜膜包裹并放入暗盒，曝光洗片。

1.6 数据统计分析

数据以平均值±标准差（x±SD）表示，采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行数据分析，采用LSD检验对各组进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 细胞总mRNA的提取

对提取的细胞总mRNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果（图1）表明，试验提取的mRNA 28S、18S、5.8S条带完整，可用于后续的反转录试验和RT-qPCR试验。

2.2 Mtb感染A549细胞Hedgehog和NF-κB信号通路相关分子及炎症细胞因子mRNA的表达变化

当BCG毒株感染A549细胞24 h时，促进了Hedgehog信号通路中Shh、Gli1和Gli2的表达，抑制了Ptch和Smo的表达（图2A），表明BCG感染促进了Hedgehog信号通路的活化。在NF-κB信号通路中，BCG毒株感染抑制了TLR2、TLR4和NF-κB的表达而促进了MyD88和炎症细胞因子IL-8和TNF-α的表达，抑制了IL-6和IL-12A的表达（图2B、图2C），这可能是因为弱毒株BCG感染引起较弱的炎症反应，且炎症反应不依赖于TLR2/TLR4的活化。

当强毒株H37Rv感染A549细胞24 h时，促进了Hedgehog信号通路中Gli1和Gli2的表达，同时也促进了NF-κB信号通路中TLR2/TLR4的表达，并显著促进了炎症细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达，对MyD88和IL-12A的表达有一定抑制作用（图2A、图2B、图2C），表明H37Rv感染能激活Hedgehog信号通路并引起A549细胞较强的炎症细胞因子分泌。结果中还发现，H37Rv毒株感染引起Shh的表达低于BCG毒株感染，而Ptch、Gli1、Gli2、TLR2/TLR4和NF-κB以及炎症细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达都高于BCG感染组。这些结果表明，H37Rv和BCG毒株感染都能激活Hedgehog信号通路并促进细胞的炎症反应，并且H37Rv毒株感染引起的炎症反应强于BCG毒株感染。

2.3 Mtb感染A549細胞Hedgehog和NF-κB信号通路相关分子的蛋白表达变化

BCG感染A549细胞24 h时，促进了Shh信号通路中Shh、Ptch和Gli1蛋白的表达，这些结果与mRNA表达一致；p-NF-κB表达水平也升高，这与NF-κB mRNA的表达不一致，可能是BCG感染促进了胞浆中NF-κB的活化（图3A、图3E）。H37Rv感染组A549细胞24 h时，促进了Ptch、Gli1和p-NF-κB的表达，H37Rv感染A549细胞引起Gli1和p-NF-κB的表达水平都高于BCG感染组（图3A、图3B、图3C、图3D）。这些结果表明，BCG和H37Rv感染都促进了Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路的活化，且H37Rv感染对Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路的活化程度高于BCG感染。

3 小结与讨论

近年来，研究发现在机体受到外源微生物入侵时，Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路等通过调控巨噬细胞、AECⅡ细胞等具有免疫调控功能的细胞，在不同程度上参与了机体的炎性应答[8，9]。当机体的组织或细胞受到感染性因素或肿瘤性因素侵袭时，由于外界刺激及压力胁迫会引起机体的免疫调控和炎性反应，发育相关的Hedgehog信号通路此时也参与了机体免疫应答的调控和炎症反应[10-12]。研究发现，Mtb感染A549细胞可激活细胞内Hedgehog信号通路，促进细胞的炎症反应和细胞存活[13]。NF-κB是一类重要的转录因子，其活化可激活下游众多的细胞因子的转录，在机体对抗外源微生物侵染时调控机体的免疫反应[14]。本试验结果表明，在Mtb感染A549细胞后，能促进Shh信号通路中Shh、Ptch和Gli1的表达，这表明Mtb感染机体能激活Hedgehog信号通路。

试验结果表明，在Mtb感染AECⅡ细胞时，虽然NF-κB在mRNA水平表达下调，但是在蛋白质水平p-NF-κB的表达水平显著上调，这是因为NF-κB是以活化形式，即磷酸化形式（p-NF-κB）在细胞免疫应答过程中发挥调控作用[15-17]。同时发现，H37Rv感染对Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路的激活作用弱于BCG感染。

IL-6可以诱导B细胞的分化，增强NK细胞的活性，抑制细胞凋亡，增强造血干细胞分化等[18]，TNF-α又叫肿瘤坏死因子，能促进T细胞产生各种炎性因子并促进炎症应答[19]。试验中，BCG毒株感染AECⅡ细胞促进了IL-8的表达，而抑制IL-6和TNF-α的表达，这种促进作用可以加强BCG毒株对机体的保护作用[20]，这与相关研究结果一致[21]。

试验中发现，H37Rv感染AECⅡ细胞引起的炎症反应强于BCG感染，这进而证实了Mtb强毒株感染可引起机体细胞较强的炎症反应和坏死，而弱毒株引起弱的炎症反应并通过免疫应答保护机体抵抗Mtb感染[22-25]。同样有研究表明，BCG和H37Rv感染肺泡上皮细胞后仅H37Rv毒株产生细胞毒性[26]。这些结果为进一步研究Mtb感染AECⅡ细胞时的免疫调控作用提供理论依据。

H37Rv和BCG毒株感染都能激活Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路，并且H37Rv感染对两种信号通路的表达促进作用弱于BCG毒株感染组。H37Rv感染组和BCG感染组都能促进细胞的炎症细胞因子表达，并且H37Rv毒株感染引起炎症细胞因子的表达作用强于BCG毒株感染组。

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