扛板归不同溶剂提取物抗氧化活性研究

侯金珍，裴世成，王云，卢慧英，韦水连，李冬明，韦啟球（通讯作者）

（1.柳州市人民医院，广西 柳州 545006；2.广西科技大学医学院，广西 柳州 545005）

0 引言

扛板归为一年生双子叶草本植物，全国各地均分布，属于蓼科蓼属植物扛板归（Polygonum perfoliatum L.）的地上部分。又称蛇见退、蛇牙草、河白草等。其具有多种药理功效，如活血化瘀、利湿消肿、清热解毒等等。实验研究结果表明，扛板归具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗诱变、降血压、抗肿瘤和止血等生物活性[1-2]。近年来国内外主要是对扛板归的黄酮类、蒽醌类、苯丙素等成分进行较多的研究报[3-4]。但对扛板归石油醚提取部位和扛板归水提液不同极性部位的研究国内外报道都比较少。

本实验以扛板归为原料，依次分别用石油醚和水回流提取扛板归，得扛板归石油醚提取部位和水提取物；水提取物分别用乙醇沉淀和不同极性的有机溶剂萃取等方法，得水提取物不同极性部位。考察扛板归不同极性部位对自由基的清除作用，评价它们的抗氧化能力，为中药扛板归在临床上的应用提供实验理论依据和进一步研究开发扛板归奠定实验基础。

1 实验部分

1.1 实验材料

FD-IA50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司），SF-200高速万能粉碎机（泰州市天泰制药机械厂），UV-2600紫外可见分光光度计（株式会社岛津制作所），XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司），DHG-9241A电热恒温干燥箱（上海圣科仪器设备有限公司），TDL-5-A台式离心机（上海安亭科学仪器厂），HH-1水浴锅（常州蒙特仪器制造有限公司），FA2204B分析天平（上海精科仪器有限公司），SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，德国），二甲基亚砜（DMSO，AR，成都市科龙化工试剂厂），抗坏血酸（Vc ，AR，天津市福晨化学试剂厂），1，10-菲啰啉（1 H2O，AR，天津市天新精细化工开发中心），硫酸亚铁（7H2O，AR，成都市科龙化工试剂厂），其他试剂均为市售分析纯。

药材采自广西壮族自治区柳州市郊区（2016年7月28日），经广西科技大学医学院韦运东副教授鉴定为蓼科蓼属植物扛板归（Polygonum perfoliatum L.）的干燥地上部分。

1.2 样品的制备

取扛板归原药材，干燥，粉碎（40目），取100 g，加30倍体积量（30 mL/g）的石油醚回流提取2 h。重复提取一次。减压抽滤，合并两次提取滤液，旋转蒸发仪减压回收石油醚，收集石油醚提取浸膏，经冷冻干燥，得扛板归石油醚提取部位（A）；同时收集药渣，挥干石油醚，待用。

取石油醚回流提取过的扛板归粉末50 g，30倍体积量（30 mL/g）的蒸馏水回流提取 1.5 h。重复提取一次。在4000 r/min的条件下，离心机离心10 min，收集离心后的上清液，合并两次提取的上清液，旋转蒸发仪浓缩至一定体积。在搅拌的作用下，缓慢向浓缩液中加入4倍浓缩液体积量的无水乙醇，4 ℃条件下放置12 h ，4000 r/min条件下，离心机离心10 min，收集沉淀物，冷冻干燥，即得扛板归醇沉物部位（B）；乙醇液相经旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味后，分散在一定体积纯化水中，依次用等体积的、不同极性的有机溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇（水饱和）充分萃取数遍。各有机相分别回收有机溶剂后得各有机相萃取物浸膏，经冷冻干燥，依次得扛板归石油醚萃取部位（C）、扛板归氯仿萃取部位（D）、扛板归乙酸乙酯萃取部位（E）和扛板归正丁醇萃取部位（F）。残余的水相经浓缩后，浸膏经冷冻干燥，得扛板归水相残余物部位（G）。收集扛板归不同极性部位A、B、C、D、E、F和G，备用。

1.3 抗氧化实验

1.3.1 DPPH自由基清除实验

DPPH自由基清除实验的方法参照Li[5]报道的方法，稍作改变。用DMSO分别配制浓度为4.0 mg/mL的样品作为母液。在序列试管中分别加入0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0 mL 的母液，分别补DMSO至1.0 mL（在反应液中终浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。每管加入 3 mL的0.1 mmol/L溶于80%（V/V）乙醇的DPPH溶液（现配现用）；样品对照组中用80%乙醇代替DPPH溶液；空白组中用DMSO代替样品溶液。以上各实验组溶液混匀后，置黑暗处，室温放置30 min。于517 nm处、1 cm光径，用1 mL DMSO和3 mL 80%乙醇溶液调零。依次测量各管吸光度值。Vc为阳性对照。每个测试管做两个平行，结果取平均值。按如下公式计样品对DPPH自由基百分清除率：DPPH清除率%=100×[A空白–（A样-A样对）]/A空白

1.3.2 羟自由基清除实验

羟自由基清除活性的测定方法参照Motoko[6]报道的方法，稍作改变。用DMSO配制浓度为4.5 mg/mL的样品作为母液。在序列试管中分别加入0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 4 .5 mg/mL的母液，分别补DMSO至1mL（在反应液中终浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）， 即 得序列浓度的样品组。样品组中每管依次加入0.5 mL pH7.4 缓冲液、1 mL 7.5 mmoL/L的 1，10-菲啰啉、1.5 mL 0.75 mmoL/L FeSO4 和0.5 mL 3% H2O2后，置于37 ℃水浴中保温1 h。于536 nm处，1 cm光径，纯化水调零，测量各管吸光度。对照组用1 mL DMSO代替样品；空白组用1.5 mL DMSO代替1 mL样品和0.5 mL 3% H2O2。Vc为阳性对照。每个测试管做两个平行，结果取平均值。按如下公式计样品对羟自由基百分清除率：

1.4 数据的处理

采用Origin 7.5 数据处理软件进行数据处理并作图。

2 结果与讨论

2.1 清除DPPH自由基实验

DPPH自由基属于有机氮自由基，其结构中含有三个苯环，夹在三个苯环中间有一个氮原子，该氮原子上有一个不成对的单电子。DPPH自由基能稳定地溶解在有机溶剂中，呈深紫色，该溶液在517 nm处有强吸收峰。由于DPPH自由基有单电子的存在，故其能接受一个电子，当溶液中有自由基清除剂存在时，DPPH自由基的单电子被配对，使其颜色变浅，从而在517 nm处吸光值会下降，且下降程度与配对电子数呈线性关系。因此可采用紫外可见分光光度仪检测实验样品对自由基的清除作用，间接的评价实验样品的抗氧化能力[7]。DPPH自由基清除实验操作简单、快速的特点，是评价抗氧化活性实验中应用广泛的一种实验方法之一。

扛板归不同极性部位对DPPH自由基的清除作用见图1。由图1可知，各部位的提取物对DPPH自由基均有一定的清除能力，随着样品浓度的增大，清除作用也不断增强，具有一定的量效相关性。当浓度达到1000 ug/mL时，提取部位A、B、C、D、E、F和G的清除率分别达到61.43%、94.08%、86.43%、88.78%、87.43%、91.55%和92.72%。结果表明，扛板归不同极性部位对DPPH自由基均具有良好的清除能力。

2.2 清除羟自由基实验

根据化学结构，自由基（Free radical）是指含有未配对电子的原子、分子或基团。目前对以碳、氮和氧为中心的活性基团研究较多，其中对活性氧（reactive oxygen species，ROS）的研究最为活跃。ROS主要是羟自由基、单线态氧和超氧阴离子等。自由基，其实是人体内正常新陈代谢的产物，一般情况下，自由基在 体内趋于动态平衡。但是当这一平衡失调，自由基就会对机体造成损害，进而引发一系列相关疾病[8]。据文献报道，由ROS引起的疾病，已超过100余种，如高血压、癌症、糖尿病、老痴呆症、动脉粥样硬化等疾病[9-10]。抗氧化剂可对体内多余的自由基起到清除作用，控制和减少自由基失衡时自由基对人体造成的损害。

扛板归不同极性部位对羟自由基清除作用结果见图2。由图2可知，提取部位B和提取部位E随着样品浓度的增加，对羟自由基清除率也在不断上升，浓度由25-1000 ug/mL时，清除率分别由0.33% - 93.80%和0.46% - 68.45%。其它极性提取部位的清除作用在该浓度下相对较弱。实验结果表明，扛板归提取物对羟自由基有很强的清除活性，活性部位主要集中在水提液醇沉部位（B）和水提液乙酸乙酯萃取部位(E)。

图1 提取物清除DPPH自由基活性Fig.1 Scavenging activity of extractson DPPHradical

图2 提取物清除羟自由基活性Fig.2 Scavenging activity of extractsonhydroxyl radical

3 结论

上述实验结果显示，扛板归不同溶剂提取物具有良好的抗氧化活性。抗氧化活性成分主要集中在水提液醇沉部位和水提液乙酸乙酯萃取部位。为中药扛板归在临床上的应用提供实验理论依据和进一步研究开发扛板归奠定实验基础。