猕猴桃果肉内生菌株鉴定及其抑菌活性分析

陈帮丹，魏 洪，黄亚励，冯 丽，李俞亭，王芳胜

(1.贵州医科大学微生物学教研室/贵州省医科大学感染与免疫学实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省六盘水市人民医院检验科，贵州六盘水 553000)

我国植物资源丰富，从植物中分离和提取具活性物质的内生菌可应用于新型活性物质的生产，制造环保、高效的新药。Ezra等从植物中分离得到具有抑菌活性的内生菌株对细菌、真菌有明显的抑制作用[1]，这为天然抗菌物质的研究提供了可靠、实用的理论依据[2]。植物内生菌是生活在植物活性组织内较为特殊的微生物，包括潜伏在宿主体内的病原微生物，是植物组织内的正常菌群，也是植物微生物生态系统中的天然组成部分[3]。有研究表明，内生细菌通常不会伤害植物的各种组织器官，而能够促进植物的生长[4-5]。天然抗菌物质具有抑菌性强、无毒、性能稳定、广谱高效等优点，已成为食品及医药研究的热点[6]。目前，从多种植物中已分离到内生菌株。程小梅等从猕猴桃枝、茎、叶及腐烂果实中可分离得到内生菌真菌和导致腐烂的细菌[7-8]；王美琴等从番茄内分离得到642株内生菌株，并应用平板法筛选出2株具有抑菌活性的菌株[9]；范晓静等从银杏内获得1株具有抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌，并采用对峙法明确其抑菌活性[10]；梁盛年等从柑橘枝叶样本中分离得到内生细菌55株，经显微镜形态观察初步鉴定这些菌株分属5个属，并采用纸片扩散法(K-B法)确定有12株具有抑菌活性[11]；王梦颖等使用平板倾注法从香蕉中获得具广谱活性的菌株[12]；Chen等应用形态学、分子生物学从兰科植物的种子和根中分离鉴定得到植物内生菌[13]；Ziyake等从骆驼刺中分离到20株内生菌，并采用琼脂扩散法筛选具抑菌活性的菌株[14]；Kumar等从姜黄中分离到对大肠埃希菌有抑菌作用的内生菌[15]。

猕猴桃为猕猴桃科猕猴桃属多年生落叶植物，果实营养丰富，有“维生素C之王”的美称，深受消费者喜爱。贵州省修文县是猕猴桃之乡，种植面积达15万hm2，挂果面积约为 3 330 hm2，产量超过4万t。目前，未见有关新鲜健康猕猴桃果实分离到具抑菌活性菌株的报道。从高产的健康猕猴桃果实中分离鉴定内生菌，研究其抑菌谱和抑菌活性，对猕猴桃天然抗菌物质的开发应用具有重要意义，可为猕猴桃产业深加工发展提供新的方向，也为其产业开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猕猴桃果实采集于贵州省修文县三金圣果有限公司猕猴桃园内。大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、白色念珠菌(ATCC10231)等标准菌株，由贵州医科大学感染与免疫实验室提供；大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、肺炎链球菌、溶血性葡萄球菌等临床菌株，由贵州省六盘水市人民医院检验科分离鉴定并保存。Luria-Bertani培养基(LB培养基)，由青岛雅各化学试剂有限公司提供；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，由鼎国生物技术有限公司提供；水解酪蛋白(Mueller-Hinton)培养基(MH培养基)，由杭州滨和微生物试剂有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 猕猴桃果实内生细菌的分离纯化 新鲜猕猴桃果实经70%乙醇溶液表面消毒[10]，用接种针挑取果肉分别于PDA培养基、LB培养基上28 ℃培养7 d，观察菌落生长情况；转种培养3次以纯化菌株，4 ℃保存，备用。

1.2.2 猕猴桃果实内生拮抗菌株的筛选 采用平板对峙法[16]，在直径为9 cm的PDA平板中央接入链格孢菌；距中央2.5 cm处接入1环培养24～48 h的分离纯化菌株菌苔，28 ℃ 培养3 d，以不接种菌株处理为对照，测定菌株对链格孢菌的抑菌活性。

1.2.3 分离菌株无菌发酵液的制备 在150 mL三角烧瓶中加入30 mL PDA液体培养基，接种内生菌到三角烧瓶中，37 ℃ 180 r/min摇床培养72 h，发酵液4 ℃ 10 000 r/min离心10 min；取上清液，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min；上清液用0.45 μm的水系、微孔滤膜过滤除菌，即得无菌发酵滤液。

1.2.4 分离菌株无菌发酵液平板倾注法培养 将无菌发酵滤液分别稀释0、2、4、8、16倍制成菌悬液，分别与MH培养基混匀；用0.5号麦氏比浊管分别将标准菌株、临床菌株配制成孢子浓度为1.5×108CFU/mL的菌液，再用0.9%氯化钠溶液(生理盐水)稀释成孢子浓度为1×105CFU/mL的菌液，接种在混匀的培养基表面，倒置于恒温箱28 ℃中培养24～48 h，观察其生长情况[12]。

1.2.5 内生菌菌株的鉴定

1.2.5.1 生理生化特性鉴定[17]将保存的菌株复苏，接种于血平板培养基上，培养箱中28 ℃培养24 h；挑起单个菌落进行革兰氏染色，油镜(100×)下观察细菌形态；根据革兰氏染色情况，挑起上面培养的单个菌落，穿刺相应乳酸、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、七叶苷、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、硝酸盐、靛基质、枸橼酸盐共13个生化管。

1.2.5.2 扫描电镜形态观察 取内生菌1 mL发酵液，8 000 r/min 室温离心1 min；弃上清，加入2.5%戊二醛，4 ℃冰箱中固定4～8 h，8 000 r/min室温离心1 min；弃上清，磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)清洗3次，按30%、50%、70%、80%、90%顺序梯度脱水，每次加入后静置15 min，8 000 r/min室温离心1 min；100%乙醇洗涤2次，用300～600 μL无水乙醇重悬浮，待用；吸取重悬液7～10 μL置于干燥仪内干燥，将干燥好的样品用双面胶置于扫描电镜专用样品台上，经离子溅射喷金后在扫描电镜下观察菌体形态结构[18]。

1.2.5.3 分子生物学鉴定 细菌菌株DNA的提取参照易润华等的方法[19]，应用16S rDNA进行PCR扩增；取5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，DNA目的条带送上海生工生物工程有限公司进行测序，将所得的16S rRNA基因序列用Blast软件与GenBank数据库进行相似性比对，采用Mega 5.0软件N-J法建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃果实内生菌的菌落特征

由图1可见，从猕猴桃果肉内分离出3株植物内生菌M1、M2、M3，经PDA培养基培养，内生菌M1菌落形态为灰色，内生菌M2菌落形态为黄褐色，内生菌M3菌落形态为白色，3株内生菌均表面粗糙，呈绒状。

2.2 猕猴桃果实内生菌拮抗菌株的筛选

试验结果(图2)表明，只接种链格孢菌的PDA平板(对照)上，链格孢菌占领整个平板，而在对峙接种M3和链格孢菌的平板上，链格孢菌则没有越过M3，2种菌之间抑菌带宽达0.5 cm，说明M3对链格孢菌丝生长有明显抑制作用。

2.3 猕猴桃果实内生菌株抑菌活性试验

2.3.1 对标准菌株的抑菌效果 由图3可见，M3无菌发酵滤液原液及其稀释液对标准菌株大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)有较好的抑菌效果，未见这2种菌株的生长。

2.3.2 对临床菌株的抑菌效果 由图4、图5可见，M3菌株无菌发酵液对革兰氏阴性临床菌株大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌有较好的抑菌效果，上述细菌在不同浓度内生菌发酵液中均未见生长，而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌的抑菌效果相对较差，上述细菌在不同浓度的内生菌发酵液中均有不同程度的生长。

2.4 内生菌株M3的鉴定

2.4.1 菌落形态观察 由图6、图7可见，菌株M3在血琼脂平板上的菌落形态为灰白色、不规则、略凸起、湿润；革兰氏染色为阴性，菌体呈球状、杆状、球杆状。

2.4.2 电镜形态观察 由图8可知，M3菌株孢子形态呈杆状，大小为2.50 μm×0.20 μm左右。

2.4.3 生理生化鉴定 由图9、表1和检索伯杰氏细菌鉴定手册可知，M3菌株的生理生化特性与碱杆菌属较为接近。

2.4.4 分子生物学和生物信息学鉴定 以M3菌株的基因组DNA为模板，用细菌通用引物进行PCR扩增，得到1条约1 500 bp的DNA片段，用DNA回收试剂盒回收该片段进行测序，序列长度为1 478 b，该序列与GenBank中16S rDNA序列进行比对，M3菌株的16SrDNA与产碱杆菌菌属的粪肠产碱杆菌同源性高达99.9%。由图10可见，菌株M3与碱杆菌属在同一分支上，遗传进化距离相对最近，这与形态学观察及生理特性的测定结果一致，可确定M3菌株属粪产碱杆菌，命名为S1142的16S rDNA序列已在GenBank中注册，序列号为HM145896.1。

3 结论与讨论

本试验从新鲜猕猴桃果实中分离到1株对革兰氏阴性临床菌株有抑菌活性的内生细菌菌株M3，该菌株抗菌谱较广，抑菌效果较好，通过生理生化反应、革兰氏染色、电镜观察、16S rDNA测序及分子生物学检测，构建系统发育树，鉴定M3菌株属于粪产碱杆菌。粪产碱杆菌一般常见由土壤中分离得到[20]，发现带有多变异性的质体，携带可制造酵素的基因，在生物工程中应用很广[21]，同时也广泛应用于制药工业、废水处理、去除农药有毒物质等方面。

随着抗生素的滥用，临床耐药菌的不断出现向人类发起一轮又一轮的挑战，以副作用小、安全性高的天然抗生素受到人们的青睐，国内外关于天然抑菌物质的抑菌研究近年来成为热门。早在10多年前，赵跃等提出探索植物天然抗菌素作为新的治疗因子应用于临床及药物开发的建议[22]。李杨等从梧桐科蛇婆子属植物中得到一个独特的喹啉酮生物碱，初步发现其甲基化衍生物对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等有抗菌活性[23]。杨澍等从鱼腥草中分离出对体外金黄色葡萄球菌和白色念珠菌、对体内金黄色葡萄球菌有明显抑制菌作用的有效成分鱼腥素[24]。本试验在猕猴桃果实中分离得到M3菌株，在医学天然抗菌物质的应用将会有重要的研究价值。M3菌株发酵液在平板对峙试验中对链格孢菌有很强的拮抗能力；在平板倾注法中，能明显抑制标准菌株大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌；在临床菌株抑制试验中，革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷柏菌均未见生长，在不同浓度M3菌株发酵液中，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、 溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌有不同程度的生长，进一步证实猕猴桃内生菌M3菌株发酵菌液对革兰氏阴性菌有抑菌作用，对革兰氏阳性菌无明显的抑菌作用。

表1 M3菌株生化鉴定结果

注：-表示呈阴性；+表示呈阳性。