人附睾蛋白4对上皮性卵巢癌的早期诊断价值

袁　捷，陈　静

(1.吉安市中医院妇产科，江西 吉安 343000；2.吉安市白塘街道社区卫生服务中心妇产科，江西 吉安 343000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢癌的60%左右，其发病率和死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤的首位[1]。由于EOC早期阶段(Ⅰ～Ⅱ期)无典型的临床表观，大多数患者确诊时已发展至晚期阶段，这也是EOC高死亡率的主要原因[2-3]。目前，临床上对EOC的早期诊断主要借助于常规超声筛查及血清CA125检测等手段，但因CA125敏感性和特异性低，导致诊断假阴率较高，联合超声检测阳性诊断率也低于20%[4]。晚期EOC患者5 a死亡率约为早期患者的3倍，高达70%～80%，且EOC的发病率和死亡率正呈逐年上升趋势[5-6]。因此，越来越多的专家和学者正致力于研究一种高敏感性和特异性的新型EOC早期诊断方法。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)可能是一类与精子成熟相关的蛋白酶抑制剂，功能尚不清楚。HE4基因表达与卵巢癌相关，因其可作为EOC诊断的一类特异性肿瘤标志物而引起广泛重视和研究[3-4]。目前，国内外针对HE4与EOC早期诊断方面的研究主要集中于血清学方面，而关于卵巢组织中特异性表达HE4的研究相对较少。本研究通过检测患者血清HE4水平，同时结合实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法探讨卵巢组织中HE4基因表达情况与血清HE4水平之间的关系，这将为HE4在EOC早期诊断中的应用提供实验依据。

1　资料与方法

1.1一般资料收集我院及江苏省人民医院于2013年3月至2016年3月期间经病理学检查确诊为EOC的患者100例(EOC组)，年龄20～69(51.17±12.28)岁；早期(Ⅰ～Ⅱ期)EOC患者44例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)EOC患者56例；组织学类型：浆液性腺癌43例，黏液性腺癌57例；组织分化程度：中、低分化73例，高分化27例。选取同期收治的良性卵巢肿瘤患者35例(良性对照组)和卵巢非肿瘤性疾病患者30例(正常对照组)。良性对照组患者年龄23～68(52.52±14.25)岁。正常对照组患者年龄24～63(51.25±15.27)岁。收集患者年龄、FIGO分期、组织分化程度和淋巴结转移等临床病理资料，其中部分EOC患者和卵巢非肿瘤性疾病患者信息样本由江苏省人民医院收集。其中正常对照组标本取自绝经宫颈癌患者手术治疗同期切除的正常卵巢组织，良性对照组标本取自卵巢囊肿和肌瘤患者手术切除的良性卵巢肿瘤组织。入组患者排除重症内科疾病，既往无其他恶性肿瘤史，首次治疗切除卵巢组织前均未接受放疗或化疗。

1.2实验试剂与仪器HE4定量检测试剂盒(电化学发光法)和全自动免疫分析仪均购自德国Roch公司。RNA提取试剂盒购自美国Promega公司，上下游引物由美国Invitrogen公司合成，一步法qPCR试剂盒和Smart SpecTMPlus核酸蛋白测定仪均购自美国Bio-Rad公司。高速组织匀浆机购自德国IKA公司。Step One PlusTM实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司。

1.3电化学发光法检测血清HE4水平所有患者于住院治疗期间进行空腹静脉采血，血液样本在4 h内离心分离，收集血清放于-80 ℃冰箱保存。行化学发光前，所有样本低温解冻，并按检测试剂盒和仪器操作步骤进行。样本溶解后于4 ℃低温保藏，并于48 h内进行检测。HE4的电化学发光检测项目参考范围为0～140 pmol·L-1，>140 pmol·L-1则记为阳性。

1.4qPCR检测HE4mRNA表达卵巢组织经高速组织匀浆机低温匀浆并提取组织RNA，应用核酸定量仪定量后控制RNA浓度在2.0 μg·L-1。一步法qPCR扩增体系配制如下：RNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR®Green Mix 10 μL，iScript逆转录酶0.25 μL，无核酶水6.95 μL，总体系为20 μL。程序设定如下：50 ℃，10 min行逆转录反应，95 ℃，60 s预变性；95 ℃，15 s变性，60 ℃，60 s退火，共36个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置，数据处理方法采用2-ΔΔCT相对定量法。

2　结果

2.1各组患者血清HE4阳性率比较各组患者血清HE4阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、良性对照组和EOC组患者血清HE4阳性率分别为0.00%(0/30)、17.14%(6/35)和75.00%(75/100)，EOC组的阳性率明显高于正常对照组和良性对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1　各组患者血清HE4阳性率比较

2.2EOC患者血清HE4阳性率与临床病理参数的关系晚期患者HE4阳性率显著高于早期患者(P<0.05)。中、低分化患者HE4阳性率显著高于高分化患者(P<0.05)。有淋巴结转移患者HE4阳性率明显高于无淋巴结转移患者(P<0.05)。见表2。

表2　EOC患者血清HE4阳性率与临床病理参数的关系

2.3各组患者卵巢组织中HE4mRNA的表达情况比较各组患者卵巢组织中HE4 mRNA的表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。EOC组患者卵巢组织中HE4 mRNA表达水平明显高于正常对照组和良性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3　各组患者卵巢组织中HE4 mRNA表达的比较

2.4EOC患者卵巢组织中HE4mRNA的表达与临床病理参数的关系与早期患者相比，晚期患者卵巢组织中HE4 mRNA表达明显上调(P<0.05)。中、低分化患者HE4 mRNA水平显著高于高分化患者(P<0.05)。同时，淋巴结转移的患者HE4 mRNA水平也均高于无淋巴结转移患者(P<0.05)。但卵巢组织中HE4 mRNA的表达均与患者年龄和组织分型无关(P>0.05)。见表4。

表4　EOC患者卵巢组织中HE4 mRNA的表达与临床病理参数的关系

3　讨论

目前，临床上常规借助CA125联合超声筛查等手段用于EOC早期诊断，但CA125存在敏感性差和组织特异性低等制约因素[4]。研究[4]显示，在EOC患者中，约20%的群体不表达或低表达CA125，且我院往期收治患者中也出现部分CA125假阳性结果，往往因患者存在个体差异及良性肿瘤等影响因素，导致常规诊断手段的EOC诊断率较低。本文所研究的HE4是一类与生殖相关的蛋白酶抑制剂类物质，其本质上是一种分泌型糖蛋白，但生物学功能目前尚不清楚[7-8]。已有研究[9]证实HE4与卵巢癌病理生理过程相关。本研究检测患者血清中的HE4水平后发现，EOC患者血清中HE4阳性率显著高于良性对照组和正常对照组，表明EOC患者体内高表达和分泌HE4。尤其在正常对照组中无HE4阳性患者，良性对照组HE4阳性率也未超过20%，这进一步提示患者血清中HE4水平变化可能与卵巢组织癌变有关。

由于HE4是一种分泌型糖蛋白，不利于组织原位检测[7-8]。因此，为了进一步探讨患者血清HE4水平与卵巢癌变之间的可能性关系，本研究利用qPCR方法检测了3组患者卵巢组织中HE4 mRNA的表达变化，结果显示EOC患者卵巢组织中HE4 mRNA的表达显著高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织，表明卵巢癌变可引起组织中HE4 mRNA表达上调，这也与HE4在卵巢癌细胞系中高表达的研究结果相一致[10]。有研究[11]显示，HE4在人体正常卵巢组织中不表达或低表达，结合血清HE4检测结果，进一步提示卵巢癌变导致组织中的HE4 mRNA表达上调，可能进一步促进了HE4蛋白的合成和分泌过程。

从EOC患者血清HE4水平和mRNA检测结果与临床病理参数的关系可以看出，以上HE4检测指标均与临床分期、细胞分化程度及淋巴结转移情况显著相关，这进一步说明HE4在EOC的发生与发展过程中扮演一定的角色。同时，HE4具有较强的组织特异性，可弥补常规CA125筛查导致的假阴性较高缺陷，因此推测HE4检测指标可用于EOC的筛查和诊断。

本研究结合qPCR等分子生物学方法，探讨了血清HE4与卵巢组织中HE4基因表达的可能性关系，这为研究HE4在EOC组织中特异性表达及血清HE4检测指标用于EOC的早期诊断等方面提供了实验依据。