雷公藤红素通过上调PTEN的表达提高顺铂对Hep3B干细胞的凋亡诱导活性

上官醉飞 毛其芬⋆

肿瘤干细胞是肿瘤组织细胞群体中一群有干细胞特征的特殊肿瘤细胞，表达CD133、Bmi-1和Oct4等干细胞表面标志。文献报道相比常规肿瘤细胞，这群肿瘤干细胞对化疗的敏感性较低，因此这群有较强自我更新能力的肿瘤干细胞是造成化疗失败和肿瘤复发的重要因素［1-2］。顺铂是治疗肝癌的有效药物，然而肝癌干细胞对顺铂的高度抵抗性常造成化疗的失败［3］，本研究探讨雷公藤红素是否能提高顺铂对肝癌干细胞的杀伤活性。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）试剂：顺铂、雷公藤红素、噻唑蓝［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5- diphenyltetrazolium bromide，MTT］、凋亡检测试剂盒购于美国Sigma-Aldrich。DMEM培养基购于美国Gibco。蛋白提取液、PTEN、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-3、Bad、Bcl-2、Bcl-xl和β-actin.兔抗人抗体购于美国Cell Signaling。CD133-FITC荧光抗体购于美国BD公司。PTEN siRNA（正向 ： GCACAAGAGGCCCUAGAUUTT，反向： AAUCUAGGGCCUCUUGUGCTT）购于上海吉玛生物。Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen。ECL试剂盒购于美国Pierce。蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠购于美国Santa Cruz。（2）细胞培养：人肝癌细胞系Hep3B购于中科院上海细胞库。Hep3B肿瘤干细胞用流式细胞仪进行分选，CD133阳性的Hep3B细胞即为Hep3B肿瘤干细胞［4］。分选后的Hep3B肿瘤干细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃恒温培养箱中培养，通入5% CO2。Hep3B肿瘤干细胞传代1次/2～3d，传代时，用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态并用DMEM培养基洗涤2次，将细胞悬液按1：3稀释后传代。

1.2 方法 （1）PTEN siRNA转染：使用Lipofectamine 2000按照试剂操作说明书步骤将50 pmol/ml PTEN siRNA转染入Hep3B肿瘤干细胞中，培养24h。（2）MTT法检测雷公藤红素和顺铂对Hep3B肿瘤干细胞细胞活力的影响 ：将Hep3B肿瘤干细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、顺铂组、雷公藤红素组、顺铂+雷公藤红素组及顺铂+雷公藤红素+PTEN siRNA组，分组培养方法见表1。药物处理时间为48h。处理完毕后在细胞培养基中加入20ml MTT（5mg/ml）培养4h，移除孔内培养基，加入100μl二甲亚砜，570nm波长下测定OD值。细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/ OD对照组×100%。（3）免疫共沉淀：将Hep3B肿瘤干细胞按上述进行分组处理，用细胞裂解缓冲液进行裂解，12000r/min离心10min，收取上清液。上清液平均分成两份，一份用作对照检测β-actin的表达水平，另一份加入Bad抗体孵育过夜，之后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2h。孵育完成后1200r/min离心5min，将琼脂糖珠离心至管底，之后小心吸去上清液，琼脂糖珠用免疫沉淀缓冲液洗涤2次后加入western blot上样缓冲液，沸水浴煮5min后备用。用Bad蛋白免疫共沉淀与Bad结合的Bcl-2和Bcl-xl蛋白。（4）Western blot实验：将Hep3B肿瘤干细胞按上述进行分组处理，之后用蛋白提取液提取总蛋白质。将总蛋白质或从（1）（2）（3）所述步骤中得到的免疫共沉淀蛋白用12%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转至PVDF膜上，用PTEN、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-3、Bad、Bcl-2、Bcl-xl或β-actin兔抗人抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。（5）细胞凋亡实验：将Hep3B肿瘤干细胞按上述进行分组处理，之后按照凋亡试剂盒说明书步骤将碘化丙啶（PI）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin-V阳性细胞即为凋亡细胞。

表1 Hep3B肿瘤干细胞实验分组方法

1.3 统计学方法 采用SPSS 14.0统计软件。所有实验均重复3次，计量资料用（x±s）表示，两组间比较用Student's t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素提高顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的杀伤活性 顺铂和雷公藤红素单独处理对Hep3B肿瘤干细胞的杀伤活性较弱，两者联合后能显著诱导Hep3B肿瘤干细胞发生死亡。Western blot实验结果显示雷公藤红素处理能显著上调Hep3B肿瘤干细胞中PTEN蛋白的表达水平，而顺铂处理对PTEN的表达水平无明显影响。当转染PTEN siRNA以阻断雷公藤红素对PTEN的诱导作用后，雷公藤红素不能提高顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的杀伤活性，表明雷公红素可能通过上调PTEN的表达增强顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的杀伤活性。见表2、图1。

表2 雷公红素增强顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的杀伤活性（x±s）

图1 雷公藤红素上调Hep3B肿瘤干细胞PTEN蛋白的表达水平

2.2 雷公藤红素通过上调PTEN的表达抑制PI3K和AKT的磷酸化 Western blot实验结果显示Hep3B肿瘤干细胞的PI3K和AKT磷酸化水平较高，顺铂单独处理对PI3K和AKT和的磷酸化水平影响不大，Hep3B肿瘤干细胞用雷公藤红素处理后，PI3K和AKT的磷酸化水平显著下降。另外，转染PTEN siRNA能显著减弱雷公藤红素对PI3K和AKT磷酸化的抑制作用，结果表明雷公藤红素通过上调PTEN的表达抑制Hep3B肿瘤干细胞中PI3K/AKT通路的磷酸化。见图2。

图2 雷公藤红素通过上调PTEN的表达抑制PI3K和AKT的磷酸化

2.3 雷公藤红素通过促进Bad与Bcl-2、Bcl-xl的结合增强顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的凋亡诱导效应 免疫共沉淀实验结果显示雷公藤红素能显著增强Bad蛋白与Bcl-2和Bcl-xl的相互作用（见图3），从而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的活性。Western blot和MTT实验结果显示雷公藤红素能显著促进顺铂依赖的caspase-3的活化（见图4）和凋亡的诱导（见图5）。另外，转染PTEN siRNA后顺铂联合雷公藤红素诱导的Bad与Bcl-2、Bcl-xl的相互作用和凋亡的发生均受到显著抑制，表明雷公藤红素通过上调PTEN的表达促进顺铂诱导的凋亡途径。

图3 雷公藤红素显著增强Bad蛋白与Bcl-2和Bcl-xl的相互作用

图4 雷公藤红素增强顺铂对Hep3B肿瘤干细胞caspase-3的活化

图5 雷公藤红素增强顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的凋亡诱导活性

3 讨论

肝癌干细胞的存在是造成肝癌细胞耐药和化疗后复发的重要因素，严重影响肝癌患者的预后［5］。顺铂是治疗肝癌的有效药物，其能阻断肿瘤细胞DNA的修复从而启动细胞凋亡程序［6］。然而肝癌干细胞的耐药性显著降低顺铂的疗效，因此靶向于肝癌干细胞的辅助治疗是提高顺铂抗肿瘤活性的有效方法。雷公藤红素是一种三萜类化合物，来源于中药雷公藤的根皮，具有多种生物活性。研究发现雷公藤红素具有一定的抗肿瘤效应，能诱发肿瘤细胞自噬或凋亡性死亡［7-8］，然而雷公藤红素在肿瘤干细胞中的作用，至今仍较少报道。在本资料中，雷公藤红素能显著提高顺铂对Hep3B肿瘤干细胞的杀伤活性，表明雷公藤红素能减弱肝癌干细胞对化疗的抵抗性。

PI3K/AKT途径的过度活化是肿瘤增殖和存活的重要因素，PI3K和AKT的磷酸化受PTEN的调控。PTEN是一种已知的抑癌基因，能通过抑制PI3K/AKT信号通路阻断肿瘤的发生。研究表明PTEN在多种肿瘤中表达失调，PTEN基因的突变或缺失是肿瘤发生的一个独立危险因素［9-10］。本资料中，雷公藤红素能上调肝癌干细胞中PTEN蛋白的表达，且雷公藤红素通过上调PTEN的表达增强提高Hep3B肿瘤干细胞对顺铂的敏感性。

Bad是Bcl-2促凋亡蛋白家族成员，是AKT激酶的底物。PI3K/AKT途径的过度活化能诱导Bad与Bcl-2或Bcl-xl发生解离，从而使Bcl-2和Bcl-xl游离出来发挥抗凋亡作用［11-12］。本实验结果表明雷公藤红素能上调肝癌干细胞中的PTEN表达水平，从而抑制肿瘤细胞的PI3K/AKT通路，使Bcl-2和Bcl-xl保持与Bad的结合从而抑制Bcl-2和Bcl-xl的抗凋亡活性，提高顺铂对肝癌肿瘤干细胞的凋亡诱导活性。

综上所述，雷公藤红素能显著增强顺铂对肝癌干细胞的杀伤活性。作者认为雷公藤红素上调PTEN的表达并抑制Bcl-2、Bcl-xl与Bad的解离，从而促进顺铂对肝癌干细胞的凋亡诱导活性。