大蒜素对硝苯地平致药物性牙龈增生的干预作用

谢静 高云云 朱形好

硝苯地平致药物性牙龈增生（DGO）是由于长期服用硝苯地平引起的牙龈纤维数量增多和体积增大，为临床常见的牙周疾病，致病率为15%～85%，国内有报道为20.8%［1］。研究显示大蒜素具有抗纤维化作用，可抑制成纤维细胞增殖、减少胶原分泌。既往研究发现将大蒜素作用于体外培养的人牙龈成纤维细胞，显示其对Ⅰ型胶原的合成及分泌有抑制作用，提示大蒜素有抗牙龈纤维化作用［2］。而转化生长因子β1（TGF-β1）是致纤维化过程中的重要因子［3-4］。2015年5月至2016年10月作者通过实验研究探讨大蒜素对硝苯地平致DGO患者牙龈成纤维细胞（HGFs）I型胶原分泌与转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）主要试剂：大蒜素注射液：山东鲁抗辰欣药业有限公司。抗波形丝蛋白抗体、角蛋白抗体、SABC试剂盒、人Ⅰ型胶原、TGF-β1ELISA试剂盒：武汉博士德公司。MTT、DMSO：Sigma公司。高糖型DMEM培养基、胰蛋白酶：美国Gibco公司。ELX800酶标仪：美国Bio-Tek公司。（2）样本来源：经患者同意，选取本院经牙周情况评价牙龈增生（gingival overgrowth，GO）指数分别为1级、2级、3级的硝苯地平致DGO患者各1例。3例患者年龄50～60岁，规则服用硝苯地平片2～6年，无糖尿病、类风湿性关节炎等其他全身性疾病史，6个月内未进行牙周治疗。（GO指数使用Pernu等的标准［5］：0：无牙龈增生；1：牙龈边缘轻度增厚或表面有明显的颗粒和肉芽；2：增生的牙龈达到牙冠的1/2；3：增生的牙龈覆盖牙冠的2/3，影响整个附着龈。）经牙周基础治疗后行龈切术，收集各例切除的增生牙龈组织分别用于实验。

1.2 方法 （1）细胞培养：采用组织块贴壁法对增生牙龈成纤维细胞进行原代培养，抗波形丝蛋白、角蛋白染色法进行细胞鉴定，酶消化法常规传代，取第5代增生牙龈成纤维细胞用于实验。（2）药物浓度及分组：MTT法测定细胞活性，依据大蒜素浓度分为4组：空白对照组（加等量不含大蒜素的培养液）；3μg/ml大蒜素组；6μg/ml大蒜素组；9μg/ml大蒜素组。每孔设6个复孔。（3）Ⅰ型胶原、TGF-β1含量测定：取对数生长期的第5代增生牙龈成纤维细胞，接种于培养皿培养24h，按不同大蒜素浓度分别更换培养基，培养72h，收集培养液用于标本含量测定。操作步骤按ELISA试剂盒说明书进行。酶标仪于450nm处读取OD值，通过标准曲线获得待测样本Ⅰ型胶原、TGF-β1的浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件。计量资料以（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，各组间两两比较采用Bonferroni检验，相同大蒜素浓度时不同增生程度牙龈间（GO=1、GO=2、GO=3）I型胶原含量比较采用协方差分析。I型胶原抑制率=（1-试验组I型胶原值/对照组I型胶原值）×100%，TGF-β1抑制率 =（1-试验组 TGF-β1值 /对照组TGF-β1值）×100%。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GO=1时不同浓度大蒜素对牙龈成纤维细胞分泌I型胶原及TGF-β1的影响 GO=1时不同浓度大蒜素对药物增生牙龈成纤维细胞分泌I型胶原、TGF-β1有抑制作用（见表1）。采用Pearson相关分析法计算GO=1时I型胶原与TGF-β1的相关系数r=0.561（P=0.004）。

表1 GO=1时不同浓度大蒜素对牙龈成纤维细胞分泌I型胶原及TGF-β1的影响（x±s）

2.2 GO=2时不同浓度大蒜素对药物增生牙龈成纤维细胞分泌I型胶原、TGF-β1的影响 采用Pearson相关分析法计算GO=2时I型胶原与TGF-β1的相关系数 r=0.823（P=0.000）。见表 2。

表2 GO=2时不同浓度大蒜素对牙龈成纤维细胞分泌I型胶原及TGF-β1的影响（x±s）

2.3 GO=3时不同浓度大蒜素对药物增生牙龈成纤维细胞分泌I型胶原、TGF-β1的影响 采用Pearson相关分析法计算GO=3时I型胶原与TGF-β1的相关系数 r=0.877（P=0.000）。见表 3。

表3 GO=3时不同浓度大蒜素对牙龈成纤维细胞分泌I型胶原及TGF-β1的影响（x±s）

3 讨论

牙龈组织中基质合成与降解的动态平衡是维持正常牙龈形态和结构的重要前提。牙龈增生的发生发展使牙周组织丧失这种动态平衡，细胞外基质尤其是I型胶原大量分泌并积聚，使牙周的内环境受到破坏。研究显示大蒜素有抗纤维化作用，可抑制成纤维细胞的增殖、减少细胞胶原的合成与分泌等［6］。作者既往研究也显示大蒜素对内毒素作用下体外培养的人牙周膜成纤维细胞I型胶原的合成及分泌具有抑制作用［7］。本资料结果显示：不同浓度大蒜素对不同严重程度患者增生牙龈成纤维细胞的I型胶原的分泌均有抑制作用，且此抑制作用随大蒜素浓度的提高而愈加明显，具有剂量依赖效应，但两两比较结果显示各浓度组间的差异并非均有统计学意义。GO=1时，3μg/ml组与对照组比较（P=1.000）、6μg/ml组与3μg/ml组比较（P=0.077）差异无统计学意义，提示对于轻度牙龈增生患者而言，低等浓度（3μg/ml）的大蒜素抑制I型胶原分泌的效果不明显，而中等浓度（6μg/ml）组虽然与对照组比较差异有统计学意义，但较低等浓度（3μg/ml）组差异无统计学意义，提示对于轻度牙龈增生，大蒜素的浓度梯度带来的抑制效果差异不明显，且需要较高的浓度才可以获得抑制作用。这一点从各组的抑制率上也有所体现。GO=2时两两比较结果显示3μg/ml组与6μg/ml组比较（P=0.071）差异无统计学意义，GO=3时两两比较结果显示各组间比较结果差异均由统计学意义，提示随着牙龈增生程度的加重，大蒜素的浓度梯度带来的抑制效果差异也越显著。针对各浓度组上的基线值而言，牙龈增生越重（即GO指数越高）的患者，其成纤维细胞分泌的I型胶原越多，结果具有统计学差异（P＜0.01），不同程度增生牙龈间（GO=1、GO=2、GO=3）两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。采用协方差分析法扣除对照组基线差异后分析相同浓度的大蒜素对不同程度牙龈增生患者的I型胶原分泌抑制作用显示：大蒜素浓度为3μg/ml或6μg/ml时，牙龈增生越严重，大蒜素对I型胶原分泌的抑制作用越明显，差异均有统计学意义（P＜0.05），两个浓度点上不同程度增生牙龈间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），提示低、中等浓度大蒜素对不同程度增生牙龈的I型胶原分泌的抑制作用不同，增生程度越高，抑制作用越显著；大蒜素浓度为9μg/ml时，大蒜素对不同程度增生牙龈间的抑制作用差异无统计学意义（P=0.346），提示高等浓度（9μg/ml）大蒜素对不同程度增生牙龈的I型胶原分泌的抑制作用相似。

大蒜素抑制成纤维细胞胶原分泌的具体机制目前尚不清楚。TGF-β1是重要的致纤维化细胞因子之一［8］，是不同因素所致组织纤维化的共同通路，如TGF-β1/Smades信号通路在纤维化发生发展中起重要作用［9］。有研究表明TGF-β1对牙周膜成纤维细胞有较显著的募集及促增殖作用，并刺激其合成胶原，促使胶原堆积，同时抑制基质金属蛋白酶分泌，从而抑制胶原降解［10-12］。由此可见，TGF-β1在成纤维细胞的趋化和增殖、胶原的合成和降解等过程中可能起到重要的调控作用。而有学者指出大蒜提取物可降低肝脏纤维化大鼠血清中TGF-β1水平［13］。本资料在测定各标本I型胶原的同时，也测定TGF-β1的含量。结果表明，不同浓度大蒜素对不同程度患者增生牙龈成纤维细胞的TGF-β1的分泌也有抑制作用，因此抑制效应的变化趋势与I型胶原的变化趋势具有相关性。GO=1时I型胶原与TGF-β1的相关系数r=0.561（P=0.004），GO=2 时 r=0.823（P=0.000），GO=3 时r=0.877（P=0.000），提示不同浓度大蒜素作用下，增生程度越高的牙龈I型胶原与TGF-β1相关性越高。以上研究结果提示TGF-β1信号传导通路可能是大蒜素抗纤维化作用的机制之一，但其具体的分子机制有待进一步的研究。