高效液相色谱法测定胡椒粉中胡椒碱的含量

朱映浩，刘波，黄为红

（1.靖江市疾病预防控制中心，江苏 靖江 214500；2.泰州市疾病预防控制中心，江苏 泰州 225300）

胡椒粉是常见的日用调味品，具有去腥提味、解油 腻、助消化的功能，有黑胡椒粉和白胡椒粉两种。胡椒粉中主要的活性物质是胡椒碱，胡椒碱在胡椒果实中的含量为1.7%～7.4%，胡椒碱易溶于乙醇、乙酸和二氯乙烷等，微溶于乙醚，不溶于水。目前，胡椒碱的测定方法主要有薄层紫外扫描法［1，2］、极谱法［3］、毛细管电泳 法［4］、紫外分 光光度 法［5，6］、高效 液 相 色 谱法［7－9］和 超 高 效 液 相 色 谱 法［10］等。GB/T 17528－1998［11］《胡椒碱含量的测定 分光光度法》利用胡椒碱在343nm波长处有最大吸收进行测定，操作简单、快速，但由于其他类似生物碱以及一些在此波长下也有吸收的物质会对测定的结果造成正干扰，因此紫外分光光度法测定的胡椒碱含量通常会比高效液相色谱法偏高。目前，紫外分光光度法已被GB/T 17528－2009《胡椒碱含量的测定 高效液相色谱法》代替［12］，有必要对其方法进一步研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Waters e－2695高效液相色谱仪（配2998PDA 紫外检测器） 美国沃特世公司；TU－1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；XDW－F100超低温粉碎仪 济南达微有限公司；BP－211D电子天平 北京赛多利斯仪器有限公司；Multi Relax旋涡混合器 德国海盗夫公司；SCQ数控定时超声波清洗机 上海声彦超声波仪器有限公司；TG18G台式离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；AFX－2001－U优柯浦纯水机 上海渝欣实业发展有限公司。

胡椒碱标准品（98%）：北京百灵威科技有限公司；甲醇（HPLC色谱纯）：德国 Merck公司；无水乙醇（HPLC色谱级）：CNW 公司；1，2－二氯乙烷（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；去离子水（18.28MΩ/cm）；胡椒粉：市售。

1.2 测定方法

1.2.1 高效液相色谱法

色谱柱：Waters Atlantis T3柱（250mm×4.6mm×5μm，沃特世公司）；流动相：甲醇∶水（75∶25）；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；紫外检测波长：343nm；进样量：20μL。

1.2.2 紫外分光光度法

用1cm比色皿，在343nm波长下，将样品待测液和标准曲线溶液分别测定吸光度，绘制校正曲线，由曲线计算出样品浓度。

1.3 标准溶液的配制

胡椒碱标准储备溶液1.0mg/mL：精密称取25mg胡椒碱，于25mL棕色容量瓶中，加乙醇溶解，定容，得浓度为1.0mg/mL的标准储备液，置于4℃冰箱备用。胡椒碱标准工作溶液10μg/mL，临用现配，用微量移液器吸取250μL胡椒碱标准储备溶液1.0mg/mL，于25mL棕色容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，得浓度为10μg/mL的标准工作溶液。

1.4 标准曲线的绘制

准确移取10μg/mL胡椒碱标准工作溶液0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10mL于10mL棕色容量瓶中，用乙醇稀释配制成0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10μg/mL的胡椒碱标准系列。取1mL放入进样瓶中，供液相色谱测定，保留时间和紫外光谱定性，外标法定量，余下溶液同时做紫外光谱测定。

1.5 样品前处理

将市售胡椒粉或胡椒粒用超低温粉碎仪磨碎，过孔径为500μm（约30目）的不锈钢筛，处理好的样品存储于棕色带盖螺口瓶中备用。称取上述胡椒粉试样0.2g（精确至0.0001g），于50mL带盖聚四氟乙烯离心管中（用黑塑料袋包裹），加入25mL乙醇，盖塞，涡旋2min，超声提取30min，3500r/min离心10min。准确移取提取液250μL，于25mL棕色比色管中，用乙醇定容至25mL，摇匀，此为待测液。用10mL注射器吸取待测液经0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液0.5mL，取续滤液1.0mL于进样瓶中供 HPLC测定，余下续滤液供紫外法测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

试验比较了 Waters Atlantis T3柱和 Waters Sunfire C18柱2种色谱柱，实验发现：C18柱，胡椒碱保留时间4.124min，出峰较快；T3柱是改进后的超纯硅胶基质C18柱，可以很好地保留胡椒碱，出峰时间12.032min，所以选择 Waters Atlantis T3柱作为分离柱，色谱图见图1。

图1 胡椒碱标准溶液液相色谱图Fig.1Standard solution liquid chromatogram of piperine

2.2 检测波长的选择

对5.0μg/mL胡椒碱标准溶液在2998PDA紫外检测器上进行全波长紫外扫描（扫描范围190～400nm），发现胡椒碱在343nm波长处具有最大紫外吸收峰，因此，选择343nm为检测波长，见图2。

图2 胡椒碱标准溶液的紫外光谱图Fig.2UV spectrogram of standard solution of piperine

2.3 样品提取溶剂的选择

根据胡椒碱的化学性质和相关文献［13，14］，本实验比较了二氯乙烷和乙醇溶剂，结果显示：对于同一份样品用二氯乙烷提取，测得胡椒碱含量3.27%，用乙醇提取，测得胡椒碱含量3.25%，两者提取效率都在95%以上，考虑到二氯乙烷溶剂的毒性和乙醇实验室的易得性，本实验选择乙醇作为提取溶剂。

2.4 提取方式的选择

胡椒碱的提取主要有2种方式，加热回流提取［15］和超声提取［16］。本实验对同一份样品分别用乙醇进行回流提取和超声提取。结果发现：回流提取，HPLC法测得胡椒碱的含量为4.23%；超声30min提取，HPLC法测得胡椒碱的含量为4.57%。由于胡椒碱见光易分解，提取时要注意避光操作，回流法所用容器无法完全闭光，超声提取只需用黑色塑料袋包裹离心管即可；另外，加热回流提取一个样品大约需要4h，耗时较长，而采用超声提取大大缩短了提取时间，且易于批量化测定。因此，本文选用超声提取。

2.5 线性范围和检出限

在本方法确定的实验条件下，以浓度（C，μg/mL）为横坐标，峰面积（A，AU）为纵坐标绘制标准工作曲线，见表1。以3倍噪声（S/N＝3）计算检出限，胡椒碱的最低检出浓度均为0.1μg/mL，若按样品取样量0.2g，萃取液体积50mL计算，方法的检出限均为25mg/kg。

表1 线性范围和回归方程Table 1Linear ranges and regression equations

2.6 回收率和精密度实验

取已知含量的胡椒粉样品3份，然后分别加入10μg/mL胡椒碱标准使用溶液0.5，1.0，2.0mL，HPLC法测定，每个添加水平重复测定6次，计算平均回收率，结果见表2。另取同一胡椒粉样品6份，加入1.0mL 10μg/mL胡椒碱标准使用溶液，处理测定，计算RSD为2.53%。

表2 样品加标回收率试验结果（n＝6）Table 2Test results of the samples with spiked recoveries（n＝6）

2.7 样品测定

采集市售胡椒粉18份，检测结果见表3。比较发现：HPLC法与UV法的测定结果存在较大差异，造成结果差异的主要原因是UV法测定时一些在此波长下也有吸收的物质造成的正干扰，因此UV法测定的胡椒碱含量通常会比HPLC法偏高。

表3 市售胡椒粉样品测定结果Table 3Determination results of pepper powder samples in the market

在实际工作中，当需要对样品做出是否合格的判定时，根据 GB/T 7900－2008《白胡椒》［17］和 GB/T 7901－2008《黑胡椒》［18］的产品质量标准要求，胡椒碱的含量要求≥4.0%，若采用该标准原引用的UV法结果进行判定，18份样品中有11份样品合格；若采用现行有效的HPLC法对结果进行判定，5份样品合格。追溯原因，笔者认为在于当初制定胡椒粉中胡椒碱含量限值≥4.0%，限于当时的紫外检测设备，基于UV法制定的产品限量；目前，随着HPLC仪器设备的普及，HPLC法替代了以前的UV法，产品检验方法更新，但相应的产品标准没有配套更新，造成了对于同一份样品用不同方法检测，得出截然相反的判断结果。本文测定结果与潘望等［19］的研究结果基本一致。

3 结论

本文建立了高效液相色谱法测定胡椒粉中胡椒碱含量的分析方法。样品经低温粉碎至30目，用乙醇超声提取30min，离心后，0.45μm滤膜过滤。采用Waters Atlantis T3色谱柱分离，甲醇∶水（75∶25）作流动相，紫外检测器波长343nm检测，出峰时间适中，峰形良好，其他生物碱不干扰胡椒碱的测定，因而定量更准确。同时，本文比较了紫外分光光度法和高效液相色谱法测定胡椒碱含量的差异，在检测结果运用时应注意。建议在胡椒粉中胡椒碱检测方法更新的同时，其相应配套的产品质量标准应同步更新修订。